丹參酮II?A磺酸鈉對大鼠油酸致急性肺損傷纖維化的干預效應

劉志平　羅力　李粉英　陳遠彬　秦少萍　賀明　曾昭智　鄭名華

1廣東藥科大學附屬第二醫院（廣州新海醫院）（廣州 510300）；2廣東省中醫院（廣州 510120）；3廣東藥科大學實驗動物中心（廣州 510006）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床常見的急重癥，是由多種原因引起的以肺泡毛細血管膜通透性增高為特征的肺損傷，是臨床重癥監護患者主要的死亡原因，現有研究［1-4］表明炎癥細胞、肺泡上皮細胞和成纖維細胞產生的細胞因子擴大和加重了肺損傷中的炎癥反應，細胞因子構成的炎癥因子網絡在其中發揮重要的作用。已有的研究表明，ALI早期即可出現纖維化，而肺纖維化對病情進展及預后有顯著影響。因此，研究ALI中炎癥因子的表達及相互關系，對更好地了解ALI纖維化發生機制及藥物干預是非常重要的，并可為其治療和預防提供新的途徑。目前而言仍沒有一種藥物對此有確切療效，為此本研究嘗試用丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對油酸誘導大鼠急性肺損傷纖維化進行干預作用，通過檢查與其相關的白介素1（IL?1）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和轉化生長因子β1（TGF?β1），探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉注射液：上海上藥第一生化藥業有限公司，批號：1603102；IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1 ELISA檢測試劑盒：上海哈靈生物科技有限公司，批號：201705；油酸：天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2016110142；10%中性福爾馬林：廣州化學試劑廠，批號：20150303。SD大鼠，雄性，180～220 g，南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2016-0041。實驗期動物飼養在屏障環境，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2012-1125。

1.2儀器FA2004B電子天平（上海精科天美），HZT?A1000電子天平（廈門華志），RM2235切片機（德國徠卡），AE2000倒置顯微鏡（廈門麥克奧迪）、HCP246恒溫培養箱（德國Memmert），3K15冷凍離心機（德國SIGMA），Infinite 200 pro酶標儀（瑞士tecan），血氣分析儀（美國ABBOTT公司），Forma 902超低溫冰箱（美國Thermo）。

1.3方法1.3.1急性肺損傷大鼠模型建立66只大鼠一次性尾靜脈注射油酸0.13 mL/kg建立急性肺損傷大鼠模型，12 h后經尾動脈取血約0.2 mL，用手持式血氣分析儀進行血氣分析，以氧合指數PaO2/FiO2≤300為造模成功。

1.3.2分組及給藥取同批正常24只大鼠尾靜脈注射生理鹽水0.13 mL/kg作為正常對照組。選取建模成功的大鼠48只，隨機分成模型組和丹參酮治療組2組，每組動物24只，正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，丹參酮治療組腹腔注射丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉注射液10 mg/kg，每天1次，連續14 d。分別于停藥第7天和14天每組隨機處死12只大鼠進行相應指標的測定。

1.3.3指標測定給藥前和停藥第7、14天進行大鼠體重測定。大鼠尾動脈采血約0.2 mL，利用血氣分析儀檢測大鼠給藥前和停藥第7、14天血液PaO2、PaO2/FiO2值。分別于停藥第7和14天取大鼠全肺稱重，并按如下公式計算肺指數：肺指數=肺重（mg）/體重（g）。取左肺稱重，置烘箱烘60℃烘干72 h，再次稱重，進行濕/干質量比（W/D）計算，以此判別大鼠肺部的水腫程度。

1.3.4肺組織形態學評價經10%福爾馬林固定停藥第7和14天大鼠的右肺上葉，按常規方法制作石蠟病理切片，染色鏡檢。每組選6張玻片，每張玻片觀察2個視野，按下述標準評定病變程度評分作為肺損傷的組織學半定量評價指標（IQA）。急性肺損傷肺組織學評分是根據肺組織充血水腫、紅細胞和炎癥細胞浸潤、肺泡腔消失的程度評為0～3分。其中0分為肺組織無充血水腫、無紅細胞和炎癥細胞浸潤，肺泡腔完好；1分為輕度充血水腫、偶見紅細胞和炎癥細胞浸潤，偶見或局限肺泡腔消失；2分為中度充血水腫、紅細胞和炎癥細胞部分充盈肺泡、肺泡腔消失＞20%；3分為顯著充血水腫、紅細胞和炎癥細胞幾乎充滿肺泡腔、肺泡腔消失大于50%。

1.3.5血清IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1含量測定分別于停藥第7和14天大鼠動脈采血3 mL，1 000 r/min離心10 min離心取血清，ELISA法測定IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1水平，含量測定實驗步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.4統計學方法數據以表示，采用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析。

2　結果

2.1丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響與模型組比較，正常對照組、丹參酮治療組大鼠在停藥7 d和14 d后其體重差異無顯著性（P＞0.05），見表1，提示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重無明顯影響。

表1　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響（n=24）Tab.1　The effect of sulfotanshinone sodium on the weight of ALI rats（n=24）±s

表1　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響（n=24）Tab.1　The effect of sulfotanshinone sodium on the weight of ALI rats（n=24）±s

注：△表示n=12，下同

組別正常對照組模型組丹參酮治療組-　-　1 0 205.21±16.39 204.17±9.97 209.48±6.95 262.38±11.68 263.57±13.86 262.20±11.41 291.54±9.86 297.36±17.34 290.74±10.75劑量（mg/kg）給藥前體重（g）停藥7 d體重（g）停藥14 d體重△（g）

2.2丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響模型組和丹參酮治療組大鼠給藥前PaO2、PaO2/FiO2值均顯著低于正常對照組，說明ALI大鼠造模成功，丹參酮治療組停藥7 d和14 d后的PaO2、PaO2/FiO2值與模型組比較差異存在顯著性（P＜0.05），明顯高于模型組大鼠，見表2。

2.3丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數及濕/干重比的影響與模型組相比，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后其肺指數及濕/干重比均有不同程度降低，除丹參酮治療組停藥7 d肺指數外其余指標差異存在顯著性（P＜0.05），見表3。

表2　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響（n=24）Tab.2　The effect of sulfotanshinone sodium on the PaO2、PaO2/FiO2of ALI rats blood（n=24）　±s

表2　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2、PaO2/FiO2值的影響（n=24）Tab.2　The effect of sulfotanshinone sodium on the PaO2、PaO2/FiO2of ALI rats blood（n=24）　±s

注：與模型組相比，*P＜0.05

劑量（mg/kg）組別正常對照組模型組丹參酮治療組--1 0給藥前PaO2（mmHg）76.04±6.37*44.54±3.20 45.50±4.11停藥7 d PaO2（mmHg）79.00±5.79*44.41±4.76 54.50±4.37*停藥14 d PaO2（mmHg）79.17±6.83*44.17±5.31 50.58±5.02*給藥前PaO2/FiO2 358.42±13.79*240.75±14.96 244.04±9.23停藥7 d PaO2/FiO2 353.33±33.89*245.00±18.11 304.83±14.20*停藥14 d PaO2/FiO2 359.75±10.04*240.33±14.46 269.92±13.31*

表3　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數及濕/干重比的影響（n=12）Tab.3　The effect of sulfotanshinone sodium on the index and wet/dry ratio of ALI rats lung（n=12）　x±s

2.4丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺組織的形態學影響肉眼可見，模型組大鼠肺表面血紅病變區，肺水腫且體積增大。經丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉干預治療后，肺表面血紅色區減少，水腫和充血大部分消失，接近正常組。光鏡下正常組肺泡腔完好，肺泡炎細胞很少，幾乎無肺水腫，支氣管上皮無變形和管周炎，無纖維化。模型組肺泡腔消失，肺泡壁增厚和炎細胞增多，肺水腫和支氣管上皮變形嚴重，肺結構破壞和纖維增殖明顯。丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉干預治療后，肺水腫和支氣管變形等現象明顯減輕或者消失，肺泡炎細胞和肺間質炎細胞明顯減少，纖維化減輕，見圖1。與模型組相比，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后其肺損傷的組織學半定量評分（IQA）均有不同程度降低，差異存在顯著性（P＜0.05），見表4。

表4　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠肺損傷組織學半定量評分的影響（n=12）Tab.4　The effect of sulfotanshinone sodium on the IQA of ALI rats lung（n=12）　x±s

2.5丹參酮II?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1水平的影響與模型組比較，正常對照組和丹參酮治療組停藥7 d和14 d后大鼠血液的IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平均明顯降低，差異存在顯著性（P＜0.05），但停藥14 d后血液PCⅢ、TGF?β1水平有一定程度上升，見表5。

3　討論

油酸型ALI模型是急性肺損傷研究中最常使用的模型之一且成模率高特點明顯，本癥是以滲出、炎癥和纖維增殖階段為特點，ALI早期即可出現肺纖維化。

本研究中大鼠注射油酸后出現肺充血水腫，肺泡壁增厚和炎細胞增多，肺損傷和纖維化增殖明顯，這些變化較好地模擬了臨床上急性肺損傷纖維化的病理變化，另外模型動物的氧合指數PaO2/FiO2≤300且肺指數和肺濕干比重明顯高于正常對照組動物，表明動物造模成功，經丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉治療后，肺水腫和支氣管變形等現象明顯減輕，炎癥細胞明顯減少，纖維化癥狀減輕，反映肺損傷病變程度的組織學半定量評分（IQA）分值降低，同時能提高動物血液中PaO2、PaO2/FiO2指數，丹參酮治療組大鼠部分指標接近正常對照組水平，這提示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對大鼠油酸型ALI模型纖維化有一定治療保護作用。文獻［5］報道，丹參酮ⅡA磺酸鈉聯合吲哚布芬能明顯改善療心源性腦栓塞患者血液流變學效應，丹參酮ⅡA磺酸鈉對小鼠接種人巨細胞病毒性肝炎有明確的治療作用，機制與其活血化瘀、降低TGF?β1、抑制小鼠肝微粒體細胞色素（450）亞型酶酶活性，促進肝功能恢復有關［6］。

表5　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平的影響Tab.5　The effect of sulfotanshinone sodium on the IL?1、TNF?α、PCⅢ and TGF?β1 of ALI rats blood（n=12）　±s

表5　丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI大鼠血液IL?1、TNF?α、PCⅢ、TGF?β1水平的影響Tab.5　The effect of sulfotanshinone sodium on the IL?1、TNF?α、PCⅢ and TGF?β1 of ALI rats blood（n=12）　±s

注：與模型組相比，*P＜0.05

劑量（mg/kg）組別正常對照組模型組丹參酮治療組-　-　1 0 IL?1（pg/mL）停藥7 d 62.08±15.61*125.42±23.90 89.83±13.23*停藥14 d 62.17±13.73*135.25±23.71 109.91±19.39*TNF?α（pg/mL）停藥7 d 165.01±37.76*414.83±36.21 260.76±24.39*停藥14 d 167.38±34.00*418.29±26.31 332.41±70.84*PCⅢ（ng/mL）停藥7 d 62.33±4.77*75.34±8.80 66.05±6.43*停藥14 d 61.03±5.78*76.01±8.94 74.34±7.93 TGF?β1（ng/mL）停藥7 d 42.95±4.08*59.75±9.68 48.93±5.96*停藥14 d 43.77±3.67*61.73±9.21 59.29±9.18

炎癥反應在ALI纖維化發生發展過程中具有重要意義，TL?1、TNF?α因子介導造成肺毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞的損傷，從而導致肺纖維化的病理基礎產生（肺毛細血管通透性增高、滲出大量富含蛋白質的肺泡液及透明膜形成等）。作為肺組織羥脯氨酸（HYP）主要的PCⅢ是機體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原纖維所特有，是組織纖維化的標志物，其含量的變化可作為衡量膠原組織代謝的重要指標，可判斷纖維化的程度。TGF?β1在肺纖維化發病機制中起重要作用的，它對成纖維細胞具有促進有絲分裂和促趨化作用，增加細胞外基質蛋白質的合成，抑制基質降解酶的生成，在正常修復過程中亞型TGF?β1的分泌是對纖維化強有力的效應劑，僅在它持續或過分表達時將會導致病理性的纖維增殖［7-9］。本實驗發現在油酸誘導的ALI纖維化模型中 IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1大量表達，這與其他文獻的研究結果相吻合，經丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉治療后其水平顯著降低，其中PCⅢ、TGF?β1因子水平接近正常對照組水平，揭示丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對ALI纖維化模型具有治療保護作用，該治療保護作用與調節上述4個因子水平的表達有關，并分別從3個方面進行保護調節：（1）直接減少細胞因子IL?1、TNF?α的產生；（2）通過降低PCⅢ減少細胞外基質的膠原蛋白沉積，從而達到防治急性肺損傷纖維化的作用；（3）可能通過抑制TGF?β1的持續或過分表達，導致病理性的纖維化減輕。但本研究尚不能說明在ALI模型纖維化發生發展中究竟涉及何種調節機制和信號通路，這有待在后期實驗做進一步的研究。

綜上所述，本研究表明丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉對大鼠油酸型ALI模型纖維化有一定治療作用，其作用機制可能與丹參酮Ⅱ?A磺酸鈉具有調節IL?1、TNF?α、PCⅢ和TGF?β1等細胞因子的表達水平有關。但其對因子水平調節機制和對信號通路的影響需做更進一步的研究。

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