泛素羧基末端水解酶37在宮頸癌組織中的表達及對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

楊雪梅　傅曉冬

1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（四川瀘州 611230）；2四川崇州市婦幼保健院（四川崇州 611280）

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其致死率高居所有婦科系統(tǒng)腫瘤首位［1-3］。隨著早期診斷技術(shù)的發(fā)展及綜合治理手段的應(yīng)用，宮頸癌的預(yù)后得到了顯著的改善［4-6］。然而，目前對于宮頸癌發(fā)生及進展的病理生理機制我們?nèi)灾跎佟８鶕?jù)分子標(biāo)志物的表達情況，實施有針對性的靶向治療也是極具潛力的治療方式。因此，進一步尋找宮頸癌中潛在的治療靶點，對于改善宮頸癌患者預(yù)后具有著極高的現(xiàn)實意義。

泛素羧基末端水解酶37（UCH37）是去泛素化酶家族成員，可與多種蛋白復(fù)合物相連，通過與蛋白酶體的相互作用，而去除與靶蛋白結(jié)合的泛素［7-8］。近年來，研究顯示UCH37在多種腫瘤中表達水平異常升高，并可作為診斷和預(yù)后的分子標(biāo)注物［9-10］。然而，宮頸癌組織中UCH37的表達及其對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，尚無研究報道。本研究擬通過qRT?PCR技術(shù)檢測宮頸癌組織及癌旁組織中UCH37在的表達情況，并分析其臨床相關(guān)性。本研究首次證明了UCH37在宮頸癌組織中表達異常升高，并與宮頸癌患者FIGO分期密切相關(guān)。更為重要的是，UCH37可促進宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，是潛在的治療靶點。

1　資料與方法

1.1一般資料收集在2013年1月至2015年12月期間西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科接受宮頸癌根治術(shù)的67例患者腫瘤組織及配對癌旁組織標(biāo)本。標(biāo)本收取后凍于液氮中供后續(xù)提取RNA使用。入組患者在術(shù)后3個月后開始進行隨訪，隨訪截止時間點設(shè)定為患者因腫瘤復(fù)發(fā)死亡或至2016年12月31日。入組患者詳細(xì)臨床病理資料見表1。本研究已經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)，所有入組患者均親自簽署知情同意書，授權(quán)課題組使用其組織標(biāo)本進行本項科學(xué)研究。

1.2方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄將液氮冷凍過的組織研磨成粉末狀，加入1 mL美國Sigma公司Trizol繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min。吸上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄上清，75%的乙醇1 mL，12 000 r/min 4℃離心5 min。沉淀加入20 μL去離子水，即為所需RNA。反轉(zhuǎn)錄采用10 μL體系，RNA定量后，取1 μL RNA，加入2 μL日本TaKaRa公司5× PrimeScript RT master，7 μL去離子水。輕柔混勻后，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃。

1.2.2qRT?PCR采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時定量PCR，首先配置PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)采用25 μL體系，組分如下：12.5 μL SYBR premix Ex TaqⅡ，1 μL UCH37或β?actin正義鏈引物，1 μL UCH37或β?actin反義鏈引物，2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8.5 μL去離子水。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 30 s；擴增95℃ 15 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品保存于4℃。UCH37引物序列如下：正義鏈 5′?TGTCTCATG?GAAAGCGACCC?3′，反義鏈 5′?ACCACAACGGA?AACACG?3′；β?actin 引物序列如下：正義鏈 5′?CGTCTTCCCCTCCATCGT?3′？，反義鏈5′?GAAGGT?GTGGTGCCAGATTT?3′。 計算公式為：UCH37 相對表達量：2-ΔΔCt=2-（（CTUCH37-CTβ?actin）待測樣本–（CTUCH37-CTβ?actin）校準(zhǔn)樣本）。

1.2.3細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染UCH37及UCH37 siRNAs 48 h至HeLa細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染UCH37 NC的HeLa細(xì)胞命名為UCH37?NC組，將轉(zhuǎn)染UCH37 siRNA1的HeLa細(xì)胞命名為UCH37?siRNA1組，將轉(zhuǎn)染UCH37 siRNA2的HeLa細(xì)胞命名為UCH37?siRNA2組。各組細(xì)胞接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置8個復(fù)孔。培養(yǎng) 24、48、72、96、120 h后取 96孔板加入CCK?8試劑，37℃孵育45 min后，將96孔板置于酶標(biāo)儀450 nm波長檢測吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4細(xì)胞凋亡分組同1.2.3，制備細(xì)胞懸液，用5 mL PBS，1 000 r/min離心 5 min，反復(fù)洗滌3次后，棄上清；加入100 μL流式洗液和FITC標(biāo)記的Annexin?V（20 μg/mL）10 μL，及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反應(yīng)20 min后，加入400 μL流式洗液，同時以加入FITC標(biāo)記的Annexin?V及PI的同型對照抗體細(xì)胞作為同型對照。利用FACScan流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5細(xì)胞周期取分組同1.2.3。制備細(xì)胞懸液，用5 mL PBS，1 000 r/min離心5 min，反復(fù)洗滌3次后，棄上清；加入100 μL流式洗液及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反應(yīng)20 min后，加入400 μL流式洗液，同時以加入PI的同型對照抗體細(xì)胞作為同型對照。利用FACScan流式細(xì)胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法本研究均采用IBM SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以表示，利用t檢驗分析67例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中UCH37的表達差異，利用Spearman秩相關(guān)分析UCH37與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，利用方差分析及t檢驗分析UCH37?NC組與UCH37?siRNAs組增殖、凋亡和周期的差異，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1UCH37 mRNA在宮頸癌及癌旁組織中的表達差異qRT?PCR結(jié)果顯示，宮頸癌組織中UCH37表達水平為7.237±1.452，癌旁組織UCH37的表達水平為1.514±0.275。利用t檢驗分析67例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織UCH37表達情況，發(fā)現(xiàn)兩者之間UCH37 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1，t=6.328，P=0.007），宮頸癌組織中UCH37 mRNA的表達水平高于癌旁組織。

2.2UCH37的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系以UCH37 mRNA表達水平的均數(shù)4.52為界限，將宮頸癌患者分為UCH37高表達組及UCH37低表達組，其中，UCH37高表達組患者例數(shù)為37例，UCH37低表達組例數(shù)為30例。利用Spearman秩相關(guān)分析UCH37表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示：UCH37的表達水平與宮頸癌患者FIGO分期（P=0.032，表1）呈正相關(guān)，而與其他病理特征無顯著相關(guān)性（表1）。

表1　宮頸癌臨床病理特征與USP表達水平的關(guān)系Tab.1　The association between clinical features of cervical cancer and UCH37 mRNA expression 例

2.3UCH37對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響qRT?PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染UCH?siRNAs的HeLa細(xì)胞中，UCH37的表達水平較轉(zhuǎn)染UCH?NC者顯著下調(diào)，兩條針對UCH37的siRNA均可顯著抑制HeLa細(xì)胞中UCH37的表達（圖2A，P＜0.05）。CCK?8實驗顯示，轉(zhuǎn)染UCH37?siRNAs的HeLa細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染UCH37?NC組增殖能力顯著降低（圖2B，t=4.143，P=0.035）。以上結(jié)果提示，UCH37可促進宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。

圖2　UCH37對HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.2　Effects of UCH37 on the proliferation of HeLa cells

2.4UCH37對宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染UCH37?siRNAs的HeLa細(xì)胞凋亡細(xì)胞（第2象限+第4象限）比例顯著高于轉(zhuǎn)染UCH37?NC組（圖3，t=5.768，P=0.014）。以上結(jié)果提示，沉默HeLa細(xì)胞中UCH37的表達可促進細(xì)胞凋亡。

2.5UCH37對宮頸癌HeLa細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染UCH37?siRNAs的HeLa細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著高于轉(zhuǎn)染UCH37?NC組（圖3，P＜ 0.05），而S期細(xì)胞比例則顯著低于轉(zhuǎn)染UCH37?NC組（圖3，t=3.134，P=0.041），兩組G2期細(xì)胞比例無顯著差異。以上結(jié)果提示，沉默HeLa細(xì)胞中UCH37的表達可阻滯細(xì)胞周期于G1期。

3　討論

UCH37是去泛素化酶家族成員，可與多種蛋白復(fù)合物相結(jié)合而進一步發(fā)揮功能。其主要機制為通過與蛋白酶體相互作用，移除靶蛋白的泛素，使靶蛋白免于被泛素酶水解［7-8］。近年來，蛋白酶體的去泛素化酶已成為新興的抗癌靶點［11-12］。UCH37也被證實在多種腫瘤中表達異常上調(diào)，如卵巢上皮癌、肝細(xì)胞癌［9］和食管鱗狀上皮癌［10］。在這些腫瘤中，異常高表達的UCH37與腫瘤的惡性病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)。與這些研究相符，本研究結(jié)果顯示，UCH37在宮頸癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織。更為重要的是，UCH37表達水平與宮頸癌FIGO分期呈正相關(guān)，提示其可能參與宮頸癌的進展。

圖3　UCH37對HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.3　Effects of UCH37 on the apoptosis of HeLa cells

圖4　UCH37對HeLa細(xì)胞周期的影響Fig.4　Effects of UCH37 on cell cycle of HeLa cells

UCH在腫瘤中發(fā)揮功能的方式主要通過與腫瘤發(fā)生及進展中的關(guān)鍵分子結(jié)合并移除其表面的泛素。如在肝細(xì)胞癌中，UCH37通過與RNA剪切的關(guān)鍵分子PRP19相結(jié)合，并使其去泛素化，從而促進肝細(xì)胞癌的侵襲及轉(zhuǎn)移［9］。另有研究表明，UCH37可移除E2啟動子區(qū)結(jié)合分子1（E2 promoter binding factor 1，E2F1）表面的賴氨酸-63連接的泛素，而促進其轉(zhuǎn)錄活化。此外，沉默UCH37的表達后，E2F1增殖相關(guān)的靶分子的表達水平亦相應(yīng)降低，腫瘤的生長也受到顯著抑制。此外，沉默UCH37的表達后，可活化Caspase?9和Capase?3的表達，從而促進細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，沉默宮頸癌HeLa細(xì)胞中UCH37的表達后細(xì)胞增殖受到明顯抑制，而凋亡細(xì)胞比率則明顯增多，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。以上研究及本研究結(jié)果提示，UCH37在腫瘤的增殖與凋亡中發(fā)揮著總要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究通過檢測宮頸癌組織及癌旁組織中UCH37 mRNA的表達水平及相關(guān)統(tǒng)計分析，初步證實了UCH37在宮頸癌組織中表達異常升高，并與宮頸癌患者FIGO分期密切相關(guān)。更為重要的是，UCH37可促進宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。本研究結(jié)果提示UCH37在宮頸癌為潛在的致癌分子，是潛在的治療靶點。

［1］TORRE L A，BRAY F，SIEGEL R L，et al.Global cancer sta?tistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87?108.

［2］陳悅張小薇，鄧志校，等.P16基因表達與宮頸癌預(yù)后相關(guān)性分析［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（15）：2417?2420.

［3］汪青松，楊林.根治性子宮切除術(shù)聯(lián)合輔助放療與同步放化療治療宮頸癌比較［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（23）：3886?3889.

［4］LI J，NING N Y，RAO Q X，et al.Pretreatment glycemic con?trol status is an independent prognostic factor for cervical can?cer patients receiving neoadjuvant chemotherapy for locally ad?vanced disease［J］.BMC Cancer，2017，17（1）：517.

［5］BANERJEE S.Bevacizumab in cervical cancer：a step forward for survival［J］.Lancet，2017［Epub ahead of print］.

［6］夏作利，陳國榮，潘丹，等.HPV E6/E7聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查在宮頸癌前病變篩查中的意義［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2017，32（18）：3053?3056.

［7］YAO T，SONG L，JIN J，et al.Distinct modes of regulation of the Uch37 deubiquitinating enzyme in the proteasome and in the Ino80 chromatin?remodeling complex［J］.Mol Cell，2008，31（6）：909?917.

［8］YAO T，SONG L，XU W，et al.Proteasome recruitment and activation of the Uch37 deubiquitinating enzyme by Adrm1［J］.Nat Cell Biol，2006，8（9）：994?1002.

［9］FANG Y，F(xiàn)U D，TANG W，et al.Ubiquitin C?terminal Hydro?lase 37，a novel predictor for hepatocellular carcinoma recur?rence，promotes cell migration and invasion via interacting and deubiquitinating PRP19［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833（3）：559?572.

［10］CHEN Y，F(xiàn)U D，XI J，et al.Expression and clinical signifi?cance of UCH37 in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2012，57（9）：2310?2317.

［11］D′ARCY P，BRNJIC S，OLOFSSON M H，et al.Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy［J］.Nat Med，2011，17（12）：1636?1640.

［12］TIAN Z，D′ARCY P，WANG X，et al.A novel small molecule inhibitor of deubiquitylating enzyme USP14 and UCHL5 induc?es apoptosis in multiple myeloma and overcomes bortezomib re?sistance［J］.Blood，2014，123（5）：706?716.