全自動蛋白測定系統在飼料粗蛋白檢測中的應用

袁艷茹

（安陽市畜產品質量安全監測檢驗中心，河南 安陽 455000）

蛋白質是生命的物質基礎，是動物一切細胞、組織的重要成分，是生命活動的重要承擔者。機體所有重要的組成部分都需要有蛋白質的參與，而且蛋白質分解后可以給畜禽提供能量［1］。蛋白質在維持動物的免疫功能及表達免疫活性中發揮著特殊的生物學作用［2］。此外，蛋白質相關的血液指標（如血紅蛋白、血清總蛋白、血清尿素氮）有所變化時，可能與畜禽的異食癖有關［3］。飼料中蛋白質的檢測有很多種，例如，李博等［4］對飼料蛋白質的幾種檢測方法的原理、特點及應用進行了綜合闡述，其中實驗室比較常見是近紅外光譜技術法和凱氏定氮法。近紅外光譜分析技術具有快速的特點，但存在靈敏度差和建模困難等缺點［5］。粗蛋白是飼料檢測的一個重要指標，凱氏定氮法是目前最常用的檢測粗蛋白含量的方法。凱氏定氮法原理是飼料樣品在催化劑（五水硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉）作用下，用濃硫酸破壞有機物，使含氮物轉化為硫酸銨，然后加入過量強堿進行蒸餾，使氮以氨氣的形式逸出，用硼酸吸收逸出的氨，之后用甲基紅溴甲酚綠為指示劑用強酸滴定硼酸銨，測出氮含量，將氮含量乘以蛋白轉換系數（6.25），計算出粗蛋白的含量［6］。而全自動蛋白測定系統則是根據經典凱氏定氮法設計的全自動消解、全自動蒸餾、全自動滴定及出結果的半微量系統，該系統為飼料中粗蛋白檢測提供了極大的便利，具有安全、準確、快速、操作簡單等特點。全自動蛋白測定系統采用石墨消解儀消解樣品，然后消解液放到全自動蛋白測定儀上固定，設好參數，蒸餾、定氮、滴定、出結果一氣呵成，在保證準確度的前提下，整個定氮滴定出結果在10 min內即可完成。現針對全自動蛋白測定系統對粗蛋白的測定進行系統性研究。

1 稱取飼料樣品

樣品稱取量應考慮樣品的含氮量，樣品含氮量高，在盡量減少稱量誤差的前提下，應稱取較少量的樣品；如果樣品的含氮量低，應稱取較多的樣品。全自動蛋白測定系統稱取樣品含氮量15～50 mg最為合適。表1為常見飼料及原料的適宜稱樣量。

稱樣時可用濾紙的1/4對折后稱樣，像包藥粉一樣，包裝完好，不能有樣品撒出來，之后把包好飼料包滑至消化管底部。同時做空白對照，即把1/4濾紙折好，直接滑至消化管底部。

2 飼料樣品消化

表1 飼料及原料適宜稱樣量

樣品消解前，每個消化管中放入一個消解片，消解片要滑到消解管的底部。消解片是由3.6 g硫酸鉀和0.4 g五水硫酸銅混勻壓制而成的。之后每個消化管中加入10 mL濃硫酸，之后把消化管連同消化管架一同放到石墨消解儀上，打開通風櫥和減壓排酸霧水管，蓋上排酸架蓋。消化儀上有20個孔位放置消化管，如果消化樣品不足20個，帶樣品的消化管放置可按照排煙管路的走向放置，剩下孔位，可去掉消化管塑料蓋或者放上加入10 mL濃硫酸的消化管，之后可按步驟消化。

儀器消化參數的設置需考慮樣品是否起泡，如果樣品起泡，可設置200℃消化0.5 h，之后400℃消化2.5 h；如果樣品不起泡，直接設置400℃消化3 h。消解儀操作界面簡單，界面僅有時間和溫度參數，設置好這兩個參數后，直接按確定鍵進行消解。儀器提示消化完成后，待消化管中霧基本消失時，可以關閉減壓排酸霧水管，取出消化架，等消化液降溫后可進行定氮蒸餾。

消解儀是石墨消解儀，石墨消解儀具有消解快速、高效、操作方便等特點，特別適合與凱氏定氮儀配合使用。此外，石墨消解儀爐內溫度連續可調，溫度恒定，可同時消解20個樣品，爐內平均溫差小，樣品消解一致性好，熱傳導效率高。石墨經過抗氧化處理，消解儀表面耐強酸強堿腐蝕，樣品各部受熱均勻，爐體孔間溫差小，可以快速、高效地消解樣品。

3 飼料樣品全自動定氮、滴定

3.1 試劑的準備

在滴定之前要準備的試劑為標定過0.1 mol/L鹽酸標準滴定液，400 g/L氫氧化鈉溶液，2%硼酸溶液，0.1%甲基紅乙醇溶液，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液，混合指示劑（甲基紅指示劑和溴甲酚綠指示劑以1∶5混合均勻）。其中，混合指示劑和2%硼酸溶液以1∶100混合均勻裝入硼酸桶；400 g/L氫氧化鈉溶液裝入堿桶；蒸餾水加入水桶，標定過滴定酸加入滴定酸桶。

3.2 全自動定氮、滴定過程

先準備3根空的消解管，打開全自動定氮儀開關，打開冷卻水開關，下面分四步進行。第一步，進行換算清洗。換算清洗要進行三四次，這個過程可以排掉滴定酸管路的氣泡，相當于潤洗滴定酸管路。第二步，把第一個空的消解管放到定氮儀上固定，之后按儀器上測試鍵，輸入相應滴定酸濃度，硼酸體積15 mL，稀釋水10 mL，堿5 mL，蒸餾5 min，設置好后按確定鍵，全自動定氮滴定開始。第一管也被稱為空蒸，以使各個管路充滿液體，也是對蒸餾管路進行預熱。接著第二三個空管按上面參數進行定氮滴定，所用滴定酸體積應小于0.05 mL，主要是看換算清洗是否徹底。此外，第二三個管各自所用滴定酸體積一般小于0.1 mL，這主要體現定氮滴定系統空體積。第三步，準備2個稱取0.1 g左右干燥過的基準硫酸銨于消化管，樣品質量輸入實際稱取硫酸銨的質量，空體積為第二步第二個管和第三個管所用滴定酸體積的平均值，堿體積改為10 mL，其他參數和第二步一樣，按確定鍵開始定氮滴定，2個硫酸銨管都進行完后，查看含氮量是否為21.19%±0.2%。如果是，可以做樣品；如果不是，可以檢查儀器的各個管路，如果儀器管路沒有問題，硫酸銨含氮量比較穩定，可以考慮做定標系數來校準儀器的系統誤差。第四步，做樣品。樣品質量按實際稱取量填寫，空白樣品質量不需填寫，堿參數改為50 mL，蛋白系數為6.25，其他參數同第一步。先做2個空白樣品，做完后2個管所用酸的體積的平均值作為樣品的空白體積。然后填入參數，即可做樣品。做完樣品后滴定酸體積、粗蛋白含量、氮含量便可顯示出來，如果需要打印直接按打印鍵。測定結果2個平行樣之間的精密度用相對偏差進行記錄，偏差要求為CB/T 6432—94的組蛋白偏差要求。

儀器設置好各個參數，按確定鍵儀器開始自動進行所有步驟。試驗步驟為加稀釋水、加硼酸、加堿、蒸餾、滴定、計算、打印和接受杯清洗（主要在于設置參數里是否選定該項，選定則有這個步驟）。在測試過程中全自動定氮滴定系統實時采集儀器多方面狀態信息：蒸汽發生器的水位，安全門在位，冷凝水有無等。如果有異常，儀器會暫停任務。全自動系統實時顯示當前操作項目及實時量，當前功能完成后自動轉移至下一試驗功能。此外，試驗過程中隨時可以暫停試驗。試驗過程中如果某個參數為0，試驗過程不開啟此項功能。

3.3 定標系數K

儀器測定樣品時，由于各系統連接會有系統誤差，為了測定結果的精確，建立偏差校正系數K。

校準時可選用干燥基準硫酸銨，直接精密稱取0.1 g左右硫酸銨于消解管中，固定在全自動定氮儀消化管位置，參數同3.2中硫酸銨測定參數相同，直接讀取結果中的含氮量。

K值的計算為K=N/N1。其中，N1為標準樣品中氮的百分含量，一般為硫酸銨理論氮的百分含量乘以其純度；N為儀器測出的標準樣品中氮的百分含量。

一般準備硫酸銨固定樣品3份，上機測定，得到3個氮的百分含量，同時得到3個K的值，3個K值平均值就是定標系數K。把定標系數填到儀器設置下定標系數，再測幾個硫酸銨固體樣品，使得含氮量在21.19%±0.2%。

4 結語

全自動蛋白測定系統具有準確、快速、安全、操作簡便的特點，本文對全自動蛋白測定系統測定飼料中粗蛋白的方法進行了探究，希望有助于該系統得到廣泛應用。

［1］蛋白質飼料對畜禽的營養作用［J］.甘肅畜牧獸醫，2017（2）：104.

［2］董佳綺，金三俊，汪晶晶，等.蛋白質營養水平對畜禽免疫作用的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫，2017（9）：80-82.

［3］李志靜，周玉香.日糧蛋白質對畜禽異食癖以及消化代謝和生理功能的影響［J］.飼料研究，2013（11）：40-43.

［4］李博，楊衛軍，張珍珍.飼料中蛋白質檢測方法的研究進展［J］.畜牧與飼料科學，2017（6）：38-40.

［5］趙雅新，王紅英.近紅外光譜技術在飼料工業中的應用進展［J］.飼料工業，2005（21）：37-41.

［6］國家技術監督局.飼料中粗蛋白測定方法：GB/T 6432—94［S］.北京：中國標準出版社，1994.