補氣益精生血法治療β地中海貧血的療效及對紅系反式作用因子的影響*

★張春紅 盧焯明 杜廣亮（.廣州市中醫醫院 廣州　5030；.廣州愛博恩婦產醫院 廣州　5030）

地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血，由于珠蛋白基因的缺陷，使一種或幾種珠蛋白肽鏈合成減少或缺乏，導致血紅蛋白的構成成分改變。地中海貧血在我國南方各省比較常見，嚴重威脅兒童、青少年健康。其治療主要包括輸血、鐵螯合劑、造血干細胞移以及基因治療等。但是前兩種治療手段存在著內皮損傷、傳染病暴露等毒副作用，造血干細胞移植因干細胞來源的稀缺及費用問題，難以廣泛開展。目前，珠蛋白基因誘導成為β地中海貧血的可行治療手段，以羥基脲為代表的各種誘導西藥有一定療效，但由于該方法存在著骨髓抑制、免疫抑制等風險，使其不能在臨床上廣泛使用。本課題組既往的研究采用補氣益精生血中藥方治療β地貧，取得了良好療效［1-2］，但具體分子機制仍在探討中。目前認為，基因治療可激活γ珠蛋白基因，增加γ珠蛋白的表達，其靶點可能是關鍵紅系反式作用因子BCL11A及其它相關紅系轉錄因子［3］。本研究運用補氣益精生血法治療β地貧患兒，檢測血液學指標以觀察療效，并與羥基脲進行隨機雙盲對照，對用藥后體內紅系反式作用因子BCL11A及其它相關紅系轉錄因子如SOX6等的蛋白水平進行分析，從而探討中藥起效的分子機制。

1　資料與方法

1.1研究對象 本研究得到醫院倫理委員會批準，納入2016年1月—2017年6月在廣州市中醫醫院就診的β地貧患兒38例。患者本人或監護人知情同意。

診斷標準：根據《血液病診斷及療效標準》（科學出版社2007年版）中對β-珠蛋白生成障礙性貧血（β地中海貧血）的診斷標準，選擇中間型地貧患者。中醫辨證參照《中醫診斷學》《中醫證候鑒別診斷學》和《中藥新藥臨床研究指導原則》，證屬腎精虧虛、氣血不足者。

納入標準：（1）年齡：2～18歲；（2）基因檢查已確診β地中海貧血，符合上述中間型β地貧診斷標準以及中醫辨證標準；（3）Hb≥60g/L；

排除標準：（1）有免疫缺陷，心臟疾病、內分泌系統及血液系統其它疾病者；（2）患者12周內有輸血或服用其他抗貧血中西藥物者；（3）既往有多種藥物過敏者；（4）既往對藥物治療依從性差者。

納入研究的患兒使用SPSS隨機數字生成器按1∶1分別進入中藥觀察組及西藥對照組。其中中藥組19例、對照組19例（研究過程中對照組脫落1例）。兩組患兒年齡、性別及 Hb水平無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1　兩組一般資料比較（，n=19）例

表1　兩組一般資料比較（，n=19）例

注：表中兩組年齡的比較，t=1.79，P＞0.05。Hb的比較，t=0.21，P＞0.05。

組別男女年齡（歲）Hb（g/dL）觀察組9105.47±2.2276.15±8.0對照組1096.63±1.7375.63±6.62

1.2研究方法

1.2.1本研究采用雙盲雙模擬法 觀察組予補氣益精生血方口服，方藥組成：黃芪、龜板、黨參、當歸，采用中藥配方顆粒劑型（廣東一方制藥有限公司生產，許可證號：粵20110214），1袋均相當于各自飲片10g的水提取物。用法與用量：2～6歲患兒以上四種顆粒每次各1袋，6～12歲患兒每次各2袋，12～18歲患兒每次各3袋，均每日1次，混合后沖服，連續每日用藥。同時加用西藥安慰劑，用法參照西藥對照組中羥基脲片的用法。

西藥對照組采用口服羥基脲治療，齊魯制藥有限公司生產（國藥準字H37021289），用法用量：10mg/kg/d，每周連用4d，停藥3d。同時加用中藥安慰劑，用法用量參照中藥觀察組。兩組藥物使用的外包裝相同，療程12周。

1.2.2中止和撤出研究標準 （1）研究期間出現Hb＜50g/L者；（2）不能堅持治療，或者研究期間使用其它可能影響血液系統的藥物者；（3）出現嚴重不良事件或不良反應者或者安全性指標明顯超出參考值范圍者，或者出現嚴重地貧并發癥者；（4）對治療藥物過敏者。對于以上（1）者予以輸血，其他情況者給予相應處理。

1.3觀察指標

1.3.1血液學指標 治療前及治療開始后的第4周、8周、12周，分別取患兒末梢血以檢測血常規，觀察血紅蛋白（Hb）、紅細胞總數（RBC）、紅細胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以手工計數法進行網織紅細胞計數（Ret）；采用堿性血紅蛋白電泳法檢測HbF比例。

1.3.2安全性指標 同上檢測血常規方法，觀察白細胞總數（WBC）、中性粒細胞總數（NEU）、血小板總數（PLT）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血進行肝、腎功能測定，觀察血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷氨酸酰基轉移酶（GGT）、血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.3.3反式作用因子蛋白水平 以Western Blot檢測BCL11A、SOX6、Myb、KLF1蛋白水平：在治療前及治療滿12周后，兩組參與研究的患兒各抽取外周血4ml，采用不連續密度梯度離心法分離包含有核紅細胞在內的單個核細胞（mononuclearcells，MNCs）。以PBS洗滌，提取MNCs細胞總蛋白并以BCA法定量。SDS-PAGE分離蛋白，蛋白質轉膜，各蛋白的單克隆抗體一抗、二抗分別先后與蛋白質雜交，以β-actin為內參照，使用超敏ECL化學發光試劑盒發光并曝光，通過圖像分析軟件分析目的蛋白條帶的與內參照條帶的積分光密度值（integrated optical density，IOD）比值。

1.4統計學處理 數據錄入 SPSS 13.0 軟件進行統計，計量資料屬正態分布以表示，同組治療前后差異采用重復測量數據方差分析及配對t檢驗，組間差異采用成組t檢驗及協方差分析。

2　結果

2.1兩組血常規指標變化的比較 兩組在不同治療時點Hb的變化，均有統計學意義，兩組治療后Hb相比，沒有明顯差異。觀察組在不同治療時點RBC的變化，有統計學意義。見表2。

2.2兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較 治療前后自身比較，兩組HbF變化均有統計學意義。觀察組治療后Ret明顯上升，對照組治療后Ret明顯下降。見表3。

表2　兩組治療前后血常規指標變化的比較（）例

表2　兩組治療前后血常規指標變化的比較（）例

注：治療12周后，兩組RBC的比較，t=14.37，#P＜0.05；兩組 Hb的比較，t=0.25，*P＞0.05；兩組MCV的比較，t=0.79，ΔP＞0.05；兩組MCH的比較，t=0.53，※P＞0.05。

組別nHb（g/L）RBC（x1012/L）MCV/fLMCH/pg觀察組19治療前74.89±2.533.45±0.1867.47±4.9820.82±1.81治療后4周75.78±1.963.61±0.1367.10±4.8921.03±1.41治療后8周83.52±2.563.73±0.1566.93±4.6020.74±1.44治療后12周90.15±2.82*3.96±0.13#67.64±4.09Δ21.61±1.15※F值207.256.041.032.35 P值0.000.000.500.08治療前77.33±8.63.45±0.1566.44±4.2020.61±1.80治療后4周78.0 ±6.623.47±0.1267.31±4.2820.33±2.04治療后8周82.83±4.893.51±0.1365.81±3.1221.05±1.52治療后12周89.88±3.893.47±0.0766.22±3.2221.86±1.27 F值196.71.030.971.07 P值0.000.450.430.40對照組18

表3　兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較（）例

表3　兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較（）例

注：治療前，兩組HbF比例、Ret的比較，無統計學意義，P＞0.05；治療后兩組HbF比例的比較，t=0.12，P＞0.05，治療后兩組Ret的比較，t=4.76，#P＜0.05。

治療前47.40±9.010.042±0.012治療后56.06±6.030.035±0.001 t值17.0613.65 P值0.000.00對照組18

2.3兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較 觀察組治療前后 WBC、NEU、PLT均無明顯變化，對照組治療后WBC、NEU明顯降低，差異有統計學意義。見表4。

表4　兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（）109/L 例

表4　兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（）109/L 例

注：治療前，兩組WBC、NEU、PLT的比較，差異無統計學意義，P＞0.05；與治療前相比，觀察組治療前后WBC、NEU、PLT均無明顯變化，P＞0.05；對照組WBC、NEU明顯降低，差異有統計學意義，*P＜0.05；治療后，兩組WBC的比較，t=7.12，#P＜0.05；兩組NEU的比較，t=13.03，#P＜0.05，兩組PLT的比較，t=0.41，P＞0.05。

組別nWBC NEUPLT觀察組19治療前7.97±0.583.85±0.62251.33±65.07治療后7.92±0.74#3.71±0.49#250.66±46.26 t值0.180.440.32 P值0.850.650.74治療前7.85±0.843.70±0.63254.31±31.06治療后5.54±1.22*1.91±0.33*255.36±17.65 t值19.0020.120.12 P值0.000.000.90對照組18

2.4兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較 治療后，觀察組BCL11A、SOX6、 Myb水平明顯下降，KLF1無變化。對照組治療前后BCL11A、SOX6、Myb、KLF1水平均無變化。見表5。

表5　兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較（）

表5　兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較（）

注：治療前，兩組BCL11A、 KLF1 、SOX6、Myb的比較，差異無統計學意義，P＞0.05；與治療前相比，觀察組治療后的BCL11A、SOX6、Myb明顯下降，差異有統計學意義，*P＜0.05；KLF1無明顯變化，P＞0.05；對照組治療前后BCL11A、SOX6、Myb、KLF1水平均無明顯變化，P＞0.05；治療后，兩組BCL11A的比較，t=8.95，#P＜0.05；SOX6的比較，t=20.16，#P＜0.05；Myb的比較，t=3.89，#P＜0.05，KLF1的比較，t=1.18，P＞0.05。

組別BCL11AKLF1SOX6Myb觀察組治療前0.52±0.100.21±0.020.56±0.140.46±0.09治療后0.27±0.07*0.19±0.03 0.24±0.06*0.33±0.07*t值24.862.0818.3617.63 P值0.000.050.000.00治療前0.53±0.100.21±0.01 0.58 ±0.110.48±0.06治療后0.54±0.11#0.20±0.02 0.58±0.04#0.44±0.10#t值0.700.521.580.96 P值0.480.600.130.34對照組

2.5兩組治療前后肝腎功能（AST、ALT、GGT、BUN、Cr）的比較 見表6。

表6　兩組治療前后肝腎功能變化的比較（）例

表6　兩組治療前后肝腎功能變化的比較（）例

注：兩組肝腎功能未見異常，治療前后兩組肝腎功能的比較，差異無統計學意義，P＞0.05。

組別nAST（U/L）ALT（U/L）GGT（U/L）BUN（mmol/L）Cr（umol/L）觀察組19治療前31.89±2.1530.42±12.3625.78±12.015.32±1.6442.50±10.44治療后30.35±3.4631.65±11.6326.74±10.366.28±1.3844.64±9.06對照組18治療前31.44±2.4730.55±10.9828.33±12.264.93±1.5243.31±9.76治療后31.56±2.8731.49±11.4327.62±11.235.86±1.3245.76±11.32

3　討論

地中海貧血是一種基因遺傳病，在中醫典籍中無明確記載，本課題組通過對其中醫證候規律的研究，擬定了補氣益精生血法為地中海貧血的主要中醫治法。既往臨床研究［1］證明，采用補氣益精生血法治療小兒β地貧，觀察組患兒的Hb及HbF水平有顯著提高，同時可以改善其他血液學指標及中醫臨床癥狀，療效優于對照組且較安全。國內多個研究［4-5］也將黃芪、黨參、當歸、山茱萸、何首烏等補腎、益氣、生血的中藥作為治療小兒β地貧的主要藥物，能顯著提高β地貧患兒Hb及HbF水平，改善貧血癥狀。本研究采用補氣益精生血治法與西藥羥基脲進行對照，療程3個月，對比了治療前后患兒的血液學指標。結果發現，治療后兩組患兒的Hb及HbF顯著上升，兩組相比無明顯差異，觀察組RBC、Ret水平顯著上升，而對照組RBC水平無明顯變化，Ret水平下降，這可能與羥基脲片本身的骨髓抑制有關。安全性方面，觀察組治療前后的WBC、NEU、PLT水平無明顯變化，對照組治療后WBC、NEU顯著降低，提示中藥觀察組在減輕免疫抑制方面有優勢。兩組患兒治療前后肝腎功能均未見異常。

珠蛋白基因誘導是近年來治療β地貧的新方向，正常情況下，γ珠蛋白基因在出生后近乎關閉，但可以通過藥物進行誘導，使其重新激活表達，以增加胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF）含量，HbF含量的增加可以在功能上代償正常血紅蛋白的不足，改善組織供氧、緩解臨床癥狀。有研究發現［6］，通過小干擾技術使BCL11A 基因表達沉默后，細胞內γ珠蛋白基因的mRNA水平較未沉默細胞明顯升高，提示BCL11A 基因對γ珠蛋白基因表達可能存在負調控作用。聶偉業等［7］采用siRNA阻斷BCL11A基因，結果顯示可以誘導β地貧患者紅系細胞γ珠蛋白基因的表達，顯著增加HbF含量。其原理可能是BCL11A 基因可以特異性地直接調控γ珠蛋白基因表達，對HbF成具有直接作用，同時不影響其他紅系轉錄因子如GATA -1、NF-E2和EKLF的表達［8-9］。其他紅系轉錄因子，如AKT、SOX6、Myb等，相關動物試驗也提示與HbF的表達高度相關［10］。Myb是一種原癌基因，可以通過調控靶基因的轉錄實現自身功能，對造血細胞的分化、增殖和凋亡均有重要作用。對地中海貧血患者的研究發現，在HbF含量增多的同時，出現了HBS1L和cMyb兩種基因表達減少，體外實驗也表明，cMyb可以影響γ-球蛋白基因表達，低表達的Myb能加速紅細胞成熟［11］。目前一些研究［12-13］提示，在β-地貧和一些血紅蛋白病的治療中，某些特異性的miRs通過調控KLF1、BCL11A和Myb等HbF相關的轉錄因子，能激活γ珠蛋白基因，誘導重新表達，從而在轉錄后水平上對患者的血紅蛋白種類和含量進行調節。因此，珠蛋白基因誘導的原理可能是通過減少BCL11A及相關轉錄因子的基因表達或抑制其蛋白活性，實現激活γ珠蛋白表達，增加HbF含量的目的。

本研究采用補氣益精生血法治療β地貧，初步探討了中藥誘導γ珠蛋白基因表達合成HbF的分子機制。筆者采用west-ern blot方法，檢測用藥前后患兒BCL11A、KLF1、SOX6、Myb蛋白水平，結果提示中藥可顯著抑制BCL11A、SOX6、Myb蛋白水平。據此推測，中藥治療β地貧的分子機制是通過抑制紅系反式作用因子BCL11A及相關紅系轉錄因子SOX6、Myb的蛋白表達水平，激活γ-珠蛋白基因表達，從而增加HbF含量。中藥組對KLF1蛋白水平無明顯影響。KLF1與紅系分化過程密切相關，它通過結合β-珠蛋白啟動因子，促進β-珠蛋白的表達以及γ-向β-珠蛋白基因的轉換和紅系分化。其作用機制與直接激活β珠蛋白基因、間接抑制γ珠蛋白基因表達有關［14］，而β地貧患兒由于β珠蛋白基因缺陷，對KLF1無法產生應答，因此，在珠蛋白誘導治療中，KLF1蛋白水平無明顯變化。本次研究中，對照組對紅系反式作用因子的蛋白水平無顯著影響，還需后期加大樣本量進行深入研究。

通過本次研究，筆者進一步證實了補氣益精生血法治療β地貧，能夠顯著提高患兒Hb及HbF水平，改善貧血癥狀，達到與對照組羥基脲相近的效果，且副作用較少，對于我國南方等地貧高發區具有較大的實用價值及廣闊的應用前景。通過檢測紅系反式作用因子的蛋白表達水平，初步探討了中藥誘導γ珠蛋白基因表達合成HbF的分子機制，隨著臨床應用的開展，后續將在分子生物學機制上進行更加深入的研究。

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