轉化生長因子β1對大鼠肺成纖維細胞內皮素受體類型的影響

孫燕妮　劉淑清　吳曉艷　楊潔　王麗敏　承解靜　劉軍

(1上海中醫藥大學附屬普陀醫院a急診內科，b中醫內科,上海　200062)

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·論著·

轉化生長因子β1對大鼠肺成纖維細胞內皮素受體類型的影響

孫燕妮a劉淑清b吳曉艷a楊潔a王麗敏a承解靜a劉軍a

(1上海中醫藥大學附屬普陀醫院a急診內科，b中醫內科,上海200062)

摘要目的：探討轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)對大鼠肺成纖維細胞內皮素受體(endothelin receptor， ETR)類型的影響。方法： 體外培養大鼠肺成纖維細胞株，并隨機分為TGF-β1 干預組、對照組。TGF-β1干預組加入含TGF-β1(10 ng/mL)的FM培養基1 mL，對照組加入1 mL FM培養基。分別培養1 d、3 d、5 d，每組每時間點設3復孔。采用熒光定量PCR法觀察各組各時間點ETRA、ETRB mRNA的表達水平。用Western blotting法觀察各組各時間點ETRA、ETRB蛋白的表達水平。結果：TGF-β1 干預組ETRA表達隨著時間變化呈降低趨勢, 3 d、5 d時顯著低于模型組(P<0.01)；而ETRB表達隨著時間變化呈升高趨勢，3 d時高于模型組(P<0.05),5 d時顯著高于模型組(P<0.01)。結論：TGF-β1刺激可誘導大鼠肺成纖維細胞ETR類型發生變化，ETRA表達減少，ETRB表達增加。

關鍵詞特發性肺間質纖維化；內皮素受體；轉化生長因子-β1 ；大鼠肺成纖維細胞

特發性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)原因不明，以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂以及最終的肺間質纖維化為特征。多數IPF患者起病隱匿，以干咳和進行性呼吸困難為主要表現，病情持續發展，最終死于呼吸衰竭。本病多為散發，發病率3～5/10萬，好發于50～70歲男性，占所有間質性肺病的65%左右，且近年來有逐步上升的趨勢[1]。本病發病機制尚不完全清楚，治療棘手，預后不良；確診病例即使早期對激素治療有反應，平均生存時間也僅2~3年，5年病死率達65%[2]。

動物實驗和臨床研究[3]表明，內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等細胞因子對IPF的形成有促進作用。本研究通過觀察TGF-β1對體外培養的大鼠肺成纖維細胞內皮素受體(endothelin receptor，ETR)類型的影響，探索IPF的治療機制。

1資料與方法

1.1材料大鼠肺成纖維細胞株、成纖維細胞專用FM培養基均購自Science Cell Research Laboratories，實驗時用3～5代細胞。TGF-β1、Trizol購自美國Sigma公司。ETRA(ab117521)、ETRB(ab117529)抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司。β-actin 抗體購自天德悅(北京)生物科技有限責任公司。辣根過氧化物酶標記的IgG購自美國Santa cruz公司。PrimeScript RT-PCR Kit和Premix EX Taq 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光探針、蛋白抽提試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及干預1×106個/mL大鼠肺成纖維細胞分別接種于6孔板中，培養18 h后，分為TGF-β1 干預組和對照組。TGF-β1干預組加入含TGF-β1(10 ng/mL)的FM培養基1 mL，對照組加入FM培養基1 mL，繼續培養。各組均觀察1 d、3 d、5 d共3個時間點，每組各時間點均設3復孔。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測肺組織中ETRA、ETRB mRNA的表達水平收集細胞(1×106個/mL)，用Trizol抽提組織總RNA，所有RNA樣品經光密度分析260 nm/280 nm均為1.8~2.0。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。20 μL反應體系的建立參照 SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]說明書：Premix Ex Taq (2×) 10μL，PCR Forward Primer (10 μM)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL，TaqMan probe 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6 μL。以肌動蛋白B-actin為內參照。樣品和內參均設3復管。PCR反應條件: 95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，50個循環。反應結束后，采用ABI7300 SDS Software自動分析熒光信號并將其轉換成Ct值(取3復管平均值)。以2-ΔΔCt法計算目的基因與內參基因熒光比值。

1.2.3Western blotting法檢測ETRA、ETRB蛋白的表達收集細胞(1×106個/mL)，按蛋白抽提試劑盒說明書抽提蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，調整樣品終濃度為4 mg/mL,煮沸5 min變性后置-70℃冰箱備用。以20 μg蛋白上樣，通過SDS-PAGE電泳分離條帶(電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，通過預染蛋白分子標志物來確定電泳停止時間)。轉膜(300 mA恒流，1 h)，封閉，洗膜，加用3%牛血清白蛋白(BSA)-TBST(Tris buffered saline with Tween)稀釋500倍的ETRA、ETRB多克隆抗體后室溫孵育10 min，4℃過夜。洗滌,二抗室溫孵育2 h,洗滌后X線膠片曝光。掃描保存圖片，用凝膠圖像系統處理分析條帶灰度值，計算ETRA/ Beta-actin、ETRB/ Beta-actin比值。

2結果

2.1實時熒光定量PCR法檢測肺組織中ETRA、ETRB mRNA的表達水平TGF-β1干預組在TGF-β1刺激后3 d、5 d ETRA mRNA表達顯著降低(P<0.01)；而ETRB mRNA在TGF-β1刺激后3 d升高(P<0.05)，5 d時升高更顯著(P<0.01)。見表1~2。

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注:與對照組比較,★★P<0.01

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注:與對照組比較,★P<0.05，★★P<0.01

2.2Western blotting法檢測ETRA、ETRB蛋白的表達TGF-β1刺激后3 d、5 d ETRA蛋白表達顯著降低(P<0.01)；而ETRB蛋白在TGF-β1刺激后3 d升高(P<0.05)，5 d時升高更顯著(P<0.01)。見表3~4、圖1~2。

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注:與對照組比較,★★P<0.01

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注:與對照組比較,★P<0.05，★★P<0.01

注：A為對照組1 d，B為對照組3 d，C為對照組5 d，D為TGF-β1干預組1 d，E為TGF-β1干預組3 d，F為TGF-β1干預組5 d

圖1Western blotting法檢測ETRA蛋白的表達

注：A為對照組1 d,B為對照組3 d,C為對照組5 d,D為TGF-β1干預組1 d,E為TGF-β1干預組3 d,F為TGF-β1干預組5 d

圖2Western blotting法檢測ETRB蛋白的表達

3討論

在肺內，ET-1主要由肺成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞等分泌。肺損傷發生后，ET-1與ETR結合，一方面介導上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[4]，通過激活PKC、PI3K、MAPK等多個信號通路， 作用于附近的肺平滑肌細胞和肺成纖維細胞等成分， 合成并釋放炎性因子，引起肺氣道和血管平滑肌收縮；并使肺成纖維細胞轉變為肌成纖維細胞，后者具有收縮功能且能夠合成并分泌大量細胞外基質(extracellular matrix, ECM)及多種細胞因子[5]。另一方面，ET-1還可以通過p38 促MAPK和PI3K/AKT信號途徑抑制成纖維細胞的凋亡，使組織修復功能失衡，使肺成纖維細胞易被ET-1和TGF-β1活化，導致膠原蛋白和ECM過度合成，最終促進IPF的發生及發展[6]。

在纖維化鼠模型中觀察發現，ET-1及其受體的表達水平增高，且ET-1的增多與膠原的沉積增加和肺損傷的嚴重程度呈正相關，而雙重ETR拮抗劑波生坦可以減輕IPF[7]。

ETR亞型在不同的組織是不一樣的，在動脈硬化時平滑肌細胞以表達ETRB為主[8]，心肌纖維化時則以表達ETRA為主[9]。ETRA和ETRB與不同的Gα蛋白結合，導致其信號轉導途徑的改變。

TGF-β1與肺纖維化關系密切，是肺纖維化過程中的最直接的細胞因子。研究[10]發現，無論在博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠模型中還是在IPF患者肺中，TGF-β1蛋白表達均升高。IGF-β1一方面可以促進成纖維細胞增殖并激活肺成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞[11]；另一方面可以抑制ECM的降解和成纖維細胞的凋亡[12]。Busnadieqo等[13]提出了TGF-β1/ET-1軸的概念，他們的研究結果表明，無論TGF-β1阻斷劑還是ETR拮抗劑均能減輕EMT并延緩組織纖維化進程。

本研究中，大鼠肺成纖維細胞經TGF-β1刺激后3 d、5 d時ETRA表達均顯著降低(P<0.01)；ETRB在TGF-β1刺激后3 d時升高(P<0.05)，5 d時升高更顯著(P<0.01)。從而證實TGF-β1刺激可誘導大鼠肺成纖維細胞的ETR類型從ETRA向ETRB轉變，與國外文獻[14]一致。

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Effects of Transforming Growth Factor-β1 on the Types of Endothelin Receptor of Rat Lung Fibroblasts

SUNYanniaLIUShuqingbWUXiaoyanaYANGJieaWANGLiminaCHENGXiejingaLIUJun11.aDepartmentofEmergency,bDepartmentofTraditionalChineseMedicine,PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China

AbstractObjective：To investigate the effect of transforming growth factor-β1(TGF-β1) on the types of endothelin receptor(ETR) of rat lung fibroblasts. Methods:Rat lung fibroblasts were cultured in vitro and randomly divided into the TGF-β1 group and the control group. In TGF-β1 group 1 mL FM cell culture medium which contained 10 ng/mL TGF-β1 was added, while 1 mL FM cell culture medium was directly added into control group. Time points were set at 1 d, 3 d, 5 d in each group, and each group was made in triplicate at each time point. The mRNA expression levels of ETRA and ETRB in each group at each time point were observed with fluorescence quantitative PCR. The protein expression levels of ETRA and ETRB in each group at each time point was observed with Western blotting. Results: The expression of ETRA in TGF-β1 group decreased over time, and was significantly lower than that in control group at 3 d and 5 d (P<0.01). However, the expression of ETRB, which increased over time, was higher than that in the control group at 3 d(P<0.05), and significantly higher than that in control group at 5 d (P<0.01). Conclusions: The types of ETR of rat lung fibroblasts change after stimulation of TGF-β1, the ETRA expression decreasing and the ETRB expression increasing.

Key WordsIdiopathic pulmonary fibrosis；Endothelin receptor；Transforming growth factor-β1；Rat lung fibroblasts

通訊作者劉軍，E-mail:pzxliujun1964@163.com

基金項目：上海中醫藥大學附屬普陀醫院重點課題(編號：2013ZD190Ⅰ)

中圖分類號R 563.9

文獻標識碼A