GrB+淋巴細胞、T-bet+淋巴細胞和CD68+巨噬細胞的表達與乳腺癌侵襲能力和預后的關系

蔣南，董禹洋，滿莉

鞍山市腫瘤醫院腫瘤內科，遼寧 鞍山1140000

乳腺癌是全世界女性最為常見的惡性腫瘤之一，根據WHO國際癌癥研究中心發布的最新統計結果，全世界每年新發的女性乳腺癌人數高達115萬例，約占全世界女性癌癥發病人數的25%，全世界每年因乳腺癌死亡的女性人數為41萬，占全部女性癌癥死亡人數的14.1%，占全部女性死亡人數的1.6%[1‐2]。中國女性乳腺癌的發病率較歐美國家低，且發病年齡低于歐美國家10歲左右，絕經前（50～54歲）乳腺癌患者的比例約占半數以上，絕經后（65～69歲）亦為發病高峰年齡。乳腺癌的病死率隨年齡的增加而升高，近年來乳腺癌的病死率呈現明顯上升趨勢。研究顯示，腫瘤細胞與鄰近細胞及鄰近組織之間發生相互作用是惡性腫瘤細胞的基本特征之一，多種途徑可以影響惡性腫瘤細胞的生物學行為[3‐4]。宿主免疫細胞與腫瘤細胞之間相互作用、相互制衡的機制涵蓋了腫瘤發展的全部過程。宿主免疫系統能夠通過識別和殺傷腫瘤細胞來抑制腫瘤發展，腫瘤細胞則能夠分泌多種細胞因子，并合成抑制性分子來降低宿主免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，腫瘤組織內的免疫狀況與惡性腫瘤的侵襲能力和預后轉歸密切相關。當腫瘤形成之后，宿主能夠通過免疫系統發揮抗腫瘤作用，其中細胞免疫在機體抗腫瘤免疫機制中發揮主要作用，而體液免疫可以發揮協同抗腫瘤作用。在腫瘤微環境中，細胞免疫能夠通過分泌穿孔素（perform，PFP）/顆粒酶B（granzyme B，GrB）介導的細胞毒性作用和Fas/Fas‐L介導的細胞凋亡途徑來發揮作用，其中PFP/GrB介導的細胞毒性作用是細胞免疫抗腫瘤作用的主要途徑[5‐6]。因此，在惡性腫瘤細胞微環境中，浸潤的GrB+淋巴細胞可以直接體現腫瘤細胞周圍的免疫反應狀態。前期研究結果顯示，腫瘤細胞周圍的免疫細胞在各種分子分型的乳腺癌組織中的浸潤密度及分布情況均存在明顯差異，腫瘤微環境中的免疫細胞在乳腺癌的發生、發展和侵襲過程中與腫瘤細胞之間的相互關聯作用目前仍存在爭議[7‐9]。因此本研究通過對乳腺癌組織中的GrB+淋巴細胞、T‐bet+淋巴細胞和CD68+巨噬細胞進行測定，探討 GrB+淋巴細胞、T‐bet+淋巴細胞和 CD68+巨噬細胞的表達與乳腺癌侵襲能力和預后的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2010年6月至2015年5月于鞍山市腫瘤醫院經病理證實的乳腺癌患者125例。納入標準：①年齡18～65歲；②性別不限；③進行手術切除并經病理證實。排除標準：①合并肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染的患者；②合并自身免疫性疾病的患者；③合并嚴重的心腦血管疾病的患者；④精神疾病患者。本研究經鞍山市腫瘤醫院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。125例乳腺癌患者的一般資料，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 隨訪方法所有患者均納入醫院臨床隨訪系統，日常復診工作由3名不參與本研究的高年資專科醫師獨立完成。乳腺癌患者的生存結果包括死亡和腫瘤復發兩種情況，隨訪方式包括電話、信函以及登門隨訪等。乳腺癌復發主要包括：局部復發（患側鎖骨上或胸壁腫瘤復發以及患側內乳淋巴結發生轉移），對側出現新發腫瘤以及遠隔部位轉移（包括對側鎖骨上和頸部淋巴結轉移，肝、骨、肺、腦等遠隔臟器的轉移）。

表1 125例乳腺癌患者的一般資料

1.2.2 實時定量聚合酶鏈式反應采用實時定量聚合酶鏈式反應（real time‐polymerase chain reac‐tion，RT‐PCR）技術測定乳腺癌患者手術標本中腫瘤上皮組織內、腫瘤間質內及瘤周組織內浸潤的腫瘤相關巨噬細胞和淋巴細胞中GrBmRNA、T-betmRNA和CD68mRNA的表達水平。應用賽默飛公司生產的Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA，以及高容量cDNA基因逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。RT‐PCR采用賽默飛公司生產的Power SEBR Green PCR Master混合試劑盒及德國Eppendorf公司生產的PCR儀，于384孔PCR板上進行高通量上樣，以避免采用不同批次試劑盒進行實驗造成的誤差，設置3個重復實驗孔，以提高結果的可靠性。按照三步法進行PCR擴增：①95℃、10 min；②95℃、10 s，55℃、30 s，72℃、35 s，共擴增40個循環；③95℃、1 min，55℃、1 min。采集數據，獲取每份樣品的CT值結果，將 GAPDH 設為內參，依據 2‐ΔΔCT法計算GrB mRNA、T-betmRNA和CD68mRNA的相對表達量。RT‐PCR產物分析方法：取PCR擴增產物，采用Goldview染料進行染色，應用凝膠圖像分析系統測定PCR產物電泳條帶的密度積分。計算公式：產物相對表達量=目標產物電泳條帶密度/β‐ac‐tion電泳條帶密度×100%。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟-件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD‐t檢驗。采用Kaplan‐Meier法繪制生存曲線，應用Log‐rank檢驗進行生存分析。采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GrB+淋巴細胞、T-bet+淋巴細胞和CD68+巨噬細胞在乳腺癌組織標本及癌旁組織標本中的表達情況

采用RT‐PCR法檢測125例乳腺癌組織標本（包括乳腺癌及其相應的癌旁組織）淋巴細胞中GrBmRNA、T-betmRNA和CD68mRNA的表達情況，結果顯示：GrBmRNA、T-betmRNA和CD68mRNA在乳腺癌上皮組織、乳腺癌間質組織、乳腺癌癌旁組織中的表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；GrBmRNA在乳腺癌上皮組織和乳腺癌間質組織中的表達水平高于乳腺癌癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；T-betmRNA和CD68mRNA在乳腺癌癌旁組織中的表達水平高于乳腺癌上皮組織和乳腺癌間質組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 GrB+淋巴細胞、T‐bet+淋巴細胞和CD68+巨噬細-胞在乳腺癌組織標本及癌旁組織中的表達量比較（± s）

注：*與乳腺癌癌旁組織比較，P＜0.05

指標GrB mRNA T-bet mRNA CD68 mRNA乳腺癌上皮組織15.33±2.42*4.33±1.59*6.33±1.82*乳腺癌間質組織12.05±2.56*5.75±1.19*7.76±1.42*乳腺癌癌旁組織3.39±0.55 11.44±2.61 13.09±3.02 F值12.582 15.046 10.271 P值0.001 0.001 0.005

2.2 乳腺癌患者中GrB+淋巴細胞的表達情況與乳腺癌侵襲能力和預后的關系

以GrB+淋巴細胞的表達量（15.33±2.42）為界限，將乳腺癌患者分為GrB+淋巴細胞高表達組（n=63）和GrB+淋巴細胞低表達組（n=62）。GrB+淋巴細胞高表達組患者的1年、3年和5年累積無復發生存率分別為66.67%、55.56%和42.86%，GrB+淋巴細胞低表達組患者的1年、3年和5年累積無復發生存率分別為45.16%、33.87%和22.58%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。分析兩組患者的預后，結果發現，相對于GrB+淋巴細胞高表達組患者，GrB+淋巴細胞低表達組患者顯示出更為不良的預后，差異有統計學意義（P＜0.05）。Cox多因素回歸分析結果表明，腫瘤最大徑＞5 cm、淋巴結轉移、孕激素受體陽性以及GrBmRNA低表達是影響乳腺癌侵襲能力和患者無復發生存率的危險因素（P＜0.05）。同時，雌激素受體（+++）是影響乳腺癌患者無復發生存率的危險因素（P＜0.05）。（表3、表4）

表3 影響乳腺癌患者腫瘤侵襲能力的多因素分析

表4 影響乳腺癌患者無復發生存率的多因素分析

2.3 乳腺癌患者中T-bet+淋巴細胞和CD68+巨噬細胞的表達情況與預后的關系

多因素回歸分析結果表明，T-betmRNA和CD68mRNA低表達是影響乳腺癌患者生存預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表5）

表5 影響乳腺癌患者生存預后的多因素分析

3 討論

關于GrB在乳腺癌組織中的表達水平與功能之間的關系很早就成為學術研究的關注點[8‐12]。近幾年，隨著惡性腫瘤轉錄組基因測序技術的進步，越來越多的研究結果顯示，人體的多種惡性腫瘤組織中GrBmRNA的表達譜存在明顯的差異性表達。有研究表明，GrBmRNA參與調控惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等生物學行為，且能夠成為潛在的惡性腫瘤診斷的分子標志物以及藥物治療靶點[13]。惡性腫瘤的形成是多個階段、多種因素相互作用的過程[13]。

本研究發現，乳腺癌上皮組織中GrB+淋巴細胞的表達明顯升高，而乳腺癌周邊組織GrB+淋巴細胞的表達相對較少。本研究還發現，乳腺癌組織內GrBmRNA低表達是影響乳腺癌侵襲能力和患者無復發生存率的獨立危險因素。筆者分析其機制，在腫瘤微環境中活化的細胞毒性T細胞和NK細胞是人體免疫系統最為重要的殺傷性細胞，活化的細胞毒性T細胞能夠通過兩個途徑殺傷腫瘤細胞：①分泌途徑，細胞毒性T細胞分泌PFP和GrB，PFP能夠在腫瘤細胞膜中形成活性通道來改變腫瘤細胞的滲透壓，同時PFP可以協同GrB導致腫瘤細胞發生溶解；②非分泌途徑，即由Fas/Fas‐L介導的細胞凋亡途徑，其中，PFP/GrB介導的細胞毒作用是主要的途徑[14]。GrB存在于活化的CD8+細胞毒性T細胞和NK細胞的細胞質中，研究顯示，GrB+淋巴細胞可以通過兩種途徑發揮細胞毒性殺傷作用：①在進行免疫識別之后，顆粒酶與靶細胞相互結合后，進入到靶細胞內部逐漸累積，最終被釋放并發揮細胞毒性作用[12,14]；②一些GrB+淋巴細胞借助免疫突觸逃逸到胞外環境，在腫瘤細胞微環境中抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲擴散[15]。在惡性腫瘤進展迅速的腫瘤組織內GrB+淋巴細胞數量明顯減少，微環境中細胞免疫的作用被抑制；而在生存預后較好的乳腺癌患者的腫瘤侵襲周邊組織中均發現含有大量的GrB+淋巴細胞。

本研究發現，CD68+巨噬細胞在乳腺癌組織中呈高表達，相比于乳腺癌組織內部，CD68+巨噬細胞在乳腺癌周邊組織中的表達更高，即CD68+巨噬細胞主要在乳腺癌周邊組織內發揮殺傷腫瘤細胞的功能。筆者探究其機理，發現巨噬細胞在惡性腫瘤的發生、發展和轉移過程中發揮重要作用[11,13]，既可以直接殺滅腫瘤細胞，又能夠通過呈遞腫瘤相關抗原的方式誘導機體免疫應答系統發揮作用，從而清除腫瘤細胞。CD68+巨噬細胞包括兩種類型：①經典活化的巨噬細胞，即M1細胞，能夠激活Th1型輔助細胞，從而殺傷病原體和腫瘤細胞；②替代性活化的巨噬細胞，即M2細胞，主要促進腫瘤的發生發展。實際上，大部分對乳腺癌浸潤巨噬細胞的研究只局限在腫瘤間質微環境中浸潤的巨噬細胞[16]，而對腫瘤上皮內浸潤的巨噬細胞研究較少。

T‐bet是調控Th0細胞向Thl/Th2分化的決定性因素[14‐15]。Thl特異性轉錄因子 T‐bet不僅在 Thl細胞分化中發揮重要作用，而且能阻斷或抑制Th2細胞分化的信號傳遞來誘導Thl細胞分化，從而發揮抗腫瘤的免疫效應[16]。本研究多因素回歸分析結果表明，T-betmRNA和CD68mRNA低表達均是影響乳腺癌生存預后的獨立危險因素。

綜上所述，GrBmRNA、T-betmRNA和CD68mRNA低表達是影響乳腺癌患者生存預后的獨立危險因素。

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