上皮性卵巢癌中化療耐藥相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)及意義分析

楊麗華，屈莉紅安丘市人民醫(yī)院婦科，山東 濰坊6 山東省海陽市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 煙臺651

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在中國其發(fā)病率僅次于乳腺癌和宮頸癌，居第3位[1]。由于宮頸癌位于盆腔深部，早期癥狀容易被忽略，故多數(shù)患者確診時已處于晚期甚至終末期，病死率較高。傳統(tǒng)的治療方案對腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞無差別殺傷，造成一系列的不良反應(yīng)。20世紀(jì)90年代，紫杉醇類藥物聯(lián)合鉑類藥物的化療方案應(yīng)用于卵巢惡性腫瘤患者，提高了短期治療效果，但是總體來看，未能明顯增加卵巢癌患者的5年生存率[2‐3]。化療耐藥性是影響治療效果和預(yù)后效果的首要因素。化療耐藥機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，是多個基因、多個水平和多個因素共同調(diào)控的結(jié)果。本研究通過免疫組化SP法檢測腫瘤蛋白P53、凋亡抑制蛋白livin、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶‐π（glu‐tathione S‐transferase‐π，GST‐π）和Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topoisomeraseⅡ，DNA TopoⅡ）等化療耐藥相關(guān)蛋白在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況，分析其與上皮性卵巢癌的治療效果及預(yù)后的關(guān)系，為靶向治療和個體化用藥方案提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2011年1月至2012年1月安丘市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)手術(shù)、病理學(xué)檢查確診的82例上皮性卵巢癌患者，取其上皮性癌變組織為研究對象，所有組織于離體15 min內(nèi)制成標(biāo)本，取材后經(jīng)甲醛完全浸泡，常規(guī)石蠟包埋，切片備用。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例經(jīng)病理學(xué)檢查，確診為上皮性卵巢癌，有完整的臨床病理資料并完成所有的術(shù)后隨訪；②術(shù)前均未接受化療、放療和免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②患者依從性差。入選的82例患者全部為女性，年齡為25～75歲，平均為（56.28±6.23）歲，其中＞50歲者有63例，≤50歲者有19例。所有患者根據(jù)美國腫瘤綜合協(xié)作網(wǎng)（Na‐tionalComprehensiveCancerNetwork，NCCN）《2009年卵巢癌臨床實(shí)踐指南》分為Ⅰ～Ⅱ期22例和Ⅲ～Ⅳ期60例[4]。根據(jù)組織分化程度分為低分化16例、中分化32例和高分化34例。患者初次就診癥狀主要為腹脹、腹痛、食欲不振、乏力和陰道內(nèi)不規(guī)則出血等。所有患者均根據(jù)自身實(shí)際情況在安丘市人民醫(yī)院行早期全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后采用以鉑類藥物為基礎(chǔ)的規(guī)范化化療方案。術(shù)后隨訪5年，將50例停止化療6個月后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或隨訪期內(nèi)一直未見復(fù)發(fā)的患者作為化療敏感組，32例停止化療6個月內(nèi)（包含6個月）復(fù)發(fā)的患者作為化療耐藥組。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)安丘市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署了對本研究的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

兔抗人P53單克隆抗體、兔抗人livin多克隆抗體、兔抗人GST‐π單克隆抗體和兔抗人TopoⅡ單克隆抗體均購于英國Abcam公司，堿性磷酸酶羊抗兔二抗購于美國Abbkine公司。SP試劑盒和DAB顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。輪轉(zhuǎn)切片機(jī)購于德國LEⅠCA公司，烤箱購于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，移液槍購于美國Eppendorf公司，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購于北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司。

1.3 檢測指標(biāo)

檢測兩組化療耐藥相關(guān)蛋白P53、livin、GST‐π和TopoⅡ表達(dá)情況。

1.4 免疫組化

采用免疫組化SP法，68℃下烤片20 min，經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后將切片完全浸泡于水中待用。37℃下用3%H2O2溶液將切片孵育10 min，達(dá)到抑制內(nèi)源性過氧化酶活性的目的。PBS沖洗3次，轉(zhuǎn)移至0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH值為6.0）中煮沸15～20 min；自然冷卻20 min后，采用物理降溫法加快冷卻至室溫，以修復(fù)抗原。PBS沖洗3次，37℃下用羊血清工作液封閉10 min，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，用新鮮配置的DAB溶液顯色，用自來水沖洗，反藍(lán)。用自來水沖洗后，用蘇木素復(fù)染30 s，常規(guī)脫水、透明，干燥后封片。用PBS替代一抗作為陰性對照，全程由同一高年資醫(yī)師完成，將人為誤差降到最小。

1.5 結(jié)果判定

采用二級計分法計算陽性細(xì)胞數(shù)量，在100倍物鏡下隨機(jī)選擇組織切片中5個細(xì)胞最密的區(qū)域，扭動鏡筒在400倍物鏡下進(jìn)行隨機(jī)計數(shù)，記錄每100個腫瘤細(xì)胞中含有的陽性細(xì)胞數(shù)，對陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。P53和TopoⅡ以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞比例＜10%為陰性，≥10%為陽性。livin和GST‐π陽性細(xì)胞比例評分：＜5%計為0分，5%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，＞75%計為4分。染色強(qiáng)度評分：無棕黃色顆粒計為0分，淺黃色顆粒計為1分，棕黃色顆粒計為2分，棕褐色顆粒計為3分。陽性細(xì)胞比例評分與染色強(qiáng)度評分相加計為總分，＜3分為陰性（－），≥3分為陽性（+）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPS-S 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以頻數(shù)和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法；繪制生存曲線，采用Log‐rank檢驗(yàn)比較；采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P53、livin、GST-π和TopoⅡ的表達(dá)情況

P53和TopoⅡ主要分布于細(xì)胞核中，livin和GST‐π主要分布于細(xì)胞質(zhì)和成細(xì)胞膜中，詳見圖1。化療敏感組P53、livin和GST‐π的陽性表達(dá)率均明顯低于化療耐藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而TopoⅡ的陽性表達(dá)率高于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

2.25 年累積生存率

采用Log‐rank檢驗(yàn)比較化療敏感組患者的5年累積生存率（58.3%）與化療耐藥組患者的5年累積生存率（12.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.631，P=0.010）。（圖2）

2.3 生存時間的影響因素

將患者的年齡、臨床分期、組織分化程度和化療敏感程度作為自變量納入Cox回歸模型，是否死亡作為因變量（賦值1=是，0=否）。分析上述因素對患者生存時間的影響，結(jié)果顯示：臨床分期和化療敏感程度是生存時間的影響因素（P＜0.05），詳見表2。

圖1 P53、livin、GST‐ π和TopoⅡ在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)

表1 兩組患者 P53、livin、GST‐ π和TopoⅡ陽性表達(dá)率的比較[ n（%）]

圖2 兩組患者的 5年累積生存率比較

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展的基本途徑，是腫瘤與宿主之間相互作用的過程，受多種因素的影響。目前，卵巢癌的主要治療方案包括卵巢癌全面分期手術(shù)和腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，輔助術(shù)后規(guī)范化療，兩者并用可以獲得良好的短期療效[5‐6]。鉑類藥物可以在卵巢癌術(shù)后初期起到較好的控制癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，然而大多數(shù)患者最終還是因?yàn)樵粡?fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡[7‐8]。化療耐藥性是導(dǎo)致遠(yuǎn)期生存率偏低的重要因素，因此，研究引起原發(fā)、繼發(fā)性耐藥的靶點(diǎn)和機(jī)制，可以更好地檢測化療效果和預(yù)后，給予靶向治療和個體化治療方案，最終達(dá)到增加患者生存率，改善生存質(zhì)量的目的。

表2 82例患者生存時間影響因素分析

化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其殺滅腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是多基因共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，凋亡調(diào)控基因的異常表達(dá)可以使患者產(chǎn)生化療耐藥性[9‐10]。P53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，是一種細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因。在正常細(xì)胞中P53基因不僅可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，防止癌變，還可以修復(fù)細(xì)胞基因缺陷，防止細(xì)胞基因突變；然而，在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中P53會發(fā)生突變，促使細(xì)胞癌變。livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，ⅠAP）的一員，不僅可以抑制細(xì)胞凋亡，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分裂。腫瘤細(xì)胞可以打破正常的細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞無限增殖，最終形成腫瘤；因此，抑制細(xì)胞凋亡是形成腫瘤的關(guān)鍵步驟。本研究中P53和livin陽性表達(dá)患者的化療效果明顯低于陰性患者，5年累積生存率也較低。究其原因可能為：P53分為野生型和突變型，在P53陽性表達(dá)的卵巢癌患者中P53分型多為突變型，可以干擾野生型P53對細(xì)胞周期的調(diào)控，使化療藥物失去誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。livin基因在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，且在臨床分期晚期或終末期的患者中更為多見，說明livin基因在卵巢癌細(xì)胞的增殖、分化和遷移過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。賈敏利和宋曉彤[11]的研究發(fā)現(xiàn)，livin基因在卵巢癌中高表達(dá)，影響患者的臨床預(yù)后，這與本研究結(jié)果一致。

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥是腫瘤化療失敗的重要原因。研究表明，GST‐π和TopoⅡ等的長期刺激，可以使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥[12‐13]。GST‐π是一種多功能藥物代謝酶，與細(xì)胞內(nèi)解毒功能有密切的關(guān)系。臨床應(yīng)用的抗癌藥物進(jìn)入體內(nèi)后，不能直接作用于癌細(xì)胞，需要在GST‐π的催化下與谷胱甘肽結(jié)合，才能發(fā)揮解毒作用，進(jìn)而殺滅癌細(xì)胞[14]。TopoⅡ存在于細(xì)胞核中，是一種可以對DNA產(chǎn)生異構(gòu)作用的酶，可以將DNA由一種拓?fù)洚悩?gòu)體轉(zhuǎn)變成為另一種拓?fù)洚悩?gòu)體，參與基因的重組、轉(zhuǎn)錄，染色單體的分離和DNA的修復(fù)過程[15]。TopoⅡ表達(dá)降低和（或）活性下降，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對TopoⅡ抑制劑類化療藥物（蒽環(huán)類和鬼臼毒素類藥物）產(chǎn)生耐藥。本研究中GST‐π陽性表達(dá)患者的化療效果明顯低于陰性患者，5年累積生存率也較低。TopoⅡ陽性表達(dá)患者的化療效果高于陰性患者，5年累積生存率也低。究其原因，可能是癌細(xì)胞中GST‐π表達(dá)較高，藥物不能與谷胱甘肽結(jié)合并轉(zhuǎn)移，進(jìn)入細(xì)胞，藥物對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，從而產(chǎn)生細(xì)胞耐藥性；而TopoⅡ陽性表達(dá)，可能增加患者化療敏感度，但是加快其臨床進(jìn)展，縮短患者的生存期。

綜上所述，P53、livin、GST‐π和 TopoⅡ可以作為上皮性卵巢癌患者化療效果和預(yù)后效果的預(yù)測指標(biāo)，根據(jù)其表達(dá)情況調(diào)整治療方案，改善患者預(yù)后。

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