不同生長期藍莓葉多酚物質含量及抗氧化活性研究

李曉英，薛 梅，樊汶樵，黃 科

（重慶文理學院a.林學與生命科學學院；b.特色植物研究院，重慶 永川 402160）

藍莓（blueberry）在我國有著十分豐富的資源，目前重慶已有多處藍莓種植基地。藍莓葉作為藍莓種植的副產物具有巨大的開發利用價值。許多研究結果表明，藍莓葉中的酚類化合物具有抗氧化、抑菌、改善血液循環、生物防御[1-3]諸多生物活性，其風味獨特，營養和保健價值均高[4-6]，其多酚含量及部分抗氧化性能均高于其果實，可作為茶飲用，亦可入藥[7-8]，很多商家把藍莓葉直接烘干作為茶出售，亦有人研制成保健茶[9]。Harris 等[10]利用高效液相色譜質譜儀分析檢測矮叢藍莓根、莖、葉和果實中的酚類物質，結果得出，藍莓葉提取物中的綠原酸含量最高，約為100 μg·mg-1；LI Chunyang等人[11]研究發現，兔眼藍莓葉的乙醇提取物中多酚類物質含量較高，且抗氧化能力強于兔眼藍莓果；Turhan 等[12]對藍莓果和藍莓葉中的多酚含量進行了比較分析，結果表明，藍莓葉中的多酚含量高于藍莓果，且藍莓葉多酚清除DPPH 自由基的能力和還原能力均強于藍莓果。Ehlenfeldt 等[13]對81 種藍莓的研究結果表明，藍莓葉中多酚的平均含量為44.80 mg·g-1，其對超氧自由基的清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的平均值為490 μmol·g-1，遠高于藍莓果實（其分別 為1.79 mg·g-1、15.9 μmol·g-1）。WANG S Y 等人[14]在對藍莓、樹莓、草莓和黑莓的果實和葉片的研究中發現，其葉片比果實均有更高的價值，果 實 中ORAC 值 的 范 圍 為35.0～162.1 μmol·g-1（干物質），而葉片中ORAC 值的范圍為205.0～728.8 μmol·g-1（干物質），隨著樹葉變得衰老，其ORAC 值和總酚含量均下降。

藍莓葉含水較多，對其開發利用必須在采摘后立即進行干燥處理。微波干燥技術具有干燥速率大、生產效率高、清潔生產、易實現自動化控制等優點，且不影響被干燥物料的色、香、味及有效成分，可起到滅酶、殺菌的作用，在需要干燥處理的各個生產領域越來越受到重視[15-16]。有關不同生長期藍莓葉的多酚含量及其功能活性方面的研究報道很少，國內僅見到楊貴云等[17]對5、6月藍莓葉中總酚含量的比較研究報道，其研究結果表明，以乙醇提取法得到的總酚含量及其對DPPH 自由基的清除能力，5月大于6月（南金品種），而南大品種則與之相反；國外僅見Routray等[18]對北美高叢藍莓葉在不同生長期其總酚、花青素的含量及抗氧化能力進行了研究。基于此，本實驗在比較分析微波與傳統干燥法對藍莓葉總酚和總黃酮的影響情況的基礎上，采用較好的干燥方法對不同生長時期采摘的藍莓葉進行干燥處理，測定其酚類物質的含量及抗氧化活性，以期為藍莓葉的適時采摘并進一步綜合開發與利用，提高藍莓種植的經濟價值提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓葉：南金3#（兔眼高叢藍莓），采自重慶市永川區五間種植基地。分別于5月初（新生枝條，長出數十葉片）、6月底（花蕾開始凋謝，初見小果）、8月初（藍莓果實采摘之后）、9月底（當年新枝生長季末，葉片顏色發生改變）此4 個生長時期采集無蟲蛀、無機械損傷、色澤鮮亮的新鮮藍莓葉，均平鋪為一層，分別采用自然干燥、微波干燥（微波輸出功率800 W，每次干燥1 min，間歇干燥10 次）、常規熱風干燥（鼓風，溫度50 ℃）方法處理樣品，至其含水量均低于8%時，粉碎后過60 目篩，密封，置于-80 ℃的冰箱中保藏。使用前，將樣品置于干燥器中平衡過夜。

蘆丁、沒食子酸（純度在95%以上），美國Sigma 公司；VC標準品、DPPH，上海金穗生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ），南京都來生物有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2104 電子天平，上海精科天平有限公司；RZ-50 高速微量離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；RRH-200 型高速多功能粉粹機，上海緣沃工貿有限公司；754 型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平開學儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 藍莓葉醇提物（ethanol extraction of blueberry leaf，EEBL）的制備

稱取0.5 g 左右藍莓葉粉末（精確到0.001 g），以料液比為1 ∶100（m∶V）的比例，分別加入50 mL 酸化甲醇水溶液（VHCl∶V70%甲醇＝0.1 ∶100.0），在40 ℃條件下水浴超聲提取30 min，放冷，用70%的酸化乙醇補足減輕的質量。以4 000 r·min-1的轉速離心10 min，取上清濾紙過濾后即得10 mg·mL-1（以藍莓葉質量計的醇提物質量濃度）的醇提物，裝入棕色瓶中，于4 ℃條件下保存以備用。

1.3.2 總酚含量的測定

參照（有所改進）Cai Yizhong 等人[19]的福林-酚法進行測定。分別取樣液1 mL，加入1 mL 的福林-酚試劑，用7.5%的碳酸鈉水溶液定容至25 mL，混勻后在室溫條件下靜置4 min，在暗處放置2 h 后，取上清液，然后用分光光度計在750 nm 波長處測定其吸光度。以沒食子酸為標準品在相同條件下測定吸光度，得到的標準曲線方程如下，結果以沒食子酸當量（mg·g-1，以干質量計，下同）表示：

y＝3.989 0x＋0.091 3，R2＝0.999 2。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用Chun 等人[20]改良的比色法進行測定。分別取樣液1 mL，加入5%的亞硝酸鈉水溶液1 mL，混勻，6 min 后加入10%的硝酸鋁水溶液1 mL，6 min 后加入0.04 g·mL-1氫氧化鈉水溶液10 mL 并混勻，用去離子水定容至25 mL，靜置15 min，將反應液充分混勻，15 min 后，取上清液在510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁為標準品，在相同條件下測定吸光度，得到的標準曲線方程如下，結果以蘆丁當量（mg·g-1）表示：

y＝0.477 2x＋0.040 6，R2＝0.999 8。

1.3.4 還原力的測定

采用Venkatachalam U 等人[21]的方法進行測定。在試管中依次加入2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，0.2 mo1·L-1、pH值為6.6），分別量取不同生長期的EEBL、抗壞血酸溶液各1 mL，再分別加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL 混勻，于50 ℃水浴保溫20 min 后快速冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液 1 mL，以5 000 r·min-1的轉速離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入蒸餾水2.5 mL、0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，充分混勻，靜置10 min 后，在700 nm 波長處測定吸光度（A），鐵還原能力用吸光度表征，以提取劑的吸光度作為空白值（A0）。

鐵還原能力＝A－A0。

1.3.5 清除DPPH 自由基能力的測定

采用李曉英等人[22]改良的方法進行測定。分別取不同濃度的EEBL 各 2 mL 加入試管中，加入0.2 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液2 mL，混勻，在避光條件下反應30 min，于517 nm 波長處測定其吸光度（A1）；將2 mL 的EEBL 分別與2 mL 的無水乙醇混勻反應后測定其吸光度（A2）；再將2 mL 的DPPH 和70%的乙醇溶液（酸化）2 mL混勻反應后測得其吸光度（A2）。按照下面的公式計算樣品對DPPH 自由基的清除率（%）。

清除率(%)＝[1－(A1－A2) /A2]×100%。

半數清除濃度（median elimination concentration，EC50）為清除50%的自由基所需樣品的質量濃度，可通過已獲得的DPPH 自由基清除率的回歸方程計算所得；以待測樣品的質量濃度為橫坐標（X），以清除率為縱坐標（Y），得到待測樣品對DPPH 自由基的清除率的關系曲線，據此曲線方程可計算得到待測樣品的EC50值。

1.3.6 總抗氧化能力的測定（FRAP 法）

參照盧引等人[23]的方法進行測定。取TPTZ溶液（用40 mmol·L-1的鹽酸配置）10 mmol·L-1、氯化鐵20 mmol·L-1和pH 值為3.6 的醋酸鈉緩沖液0.3 mol·L-1，將此3 種溶液按1 ∶1 ∶10 的比例混合后制成現配現用的FRAP 工作液。分別吸取不同濃度的EEBL 各0.3 mL 加入試管中，再分別加入3 mL 的工作液，于70 ℃下反應10 min，測定593 nm處的吸光度，并且以VC作為陽性對照。同時，配制濃度為0.05～0.40 mmol·L-1的硫酸亞鐵標準溶液以制作標準曲線，得到的回歸曲線方程為：

y＝1.704 4x＋0.113 7，R2＝0.998 6。

以所測吸光度值對應的硫酸亞鐵毫摩爾數表示樣品總抗氧化活力的FRAP 值。

1.3.7 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 不同干燥方法對藍莓葉酚類物質含量的影響

采用自然干燥、常規熱風干燥和微波干燥這3 種方法對4 個生長時期的藍莓葉分別進行干燥處理，并采用乙醇提取酚類物質，測定并計算得到總酚和總黃酮含量，結果見圖1。由圖1可知，不同干燥方法對藍莓葉中總酚、總黃酮的含量均有不同程度的影響。微波干燥法對藍莓葉酚類物質的影響最小，其次是熱風干燥，自然干燥的效果最差。以熱風干燥法處理的藍莓葉其總酚含量與以微波干燥法處理的相當，僅在5月時存在顯著差異（P＜0.05），這可能因為這個時期的葉片含水量較高，熱風干燥處理時間較長，導致酚類物質被氧化。以微波干燥法處理的藍莓葉在4 個生長期其總黃酮含量均大于熱風干燥處理的樣品，且每個生長時期的總黃酮含量間均存在顯著差異（P＜0.05），說明微波快速干燥處理能較好地保留原材料中的活性成分，因此以下實驗樣品均采用微波干燥方法進行處理。

圖1 不同干燥法對不同生長時期藍莓葉中總酚和總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of different drying methods on total phenolic and total flavonoid contents in blueberry leaves during different growth periods

2.2 不同生長期藍莓葉醇提物鐵還原力的比較

還原力的測定是檢驗樣品是否為良好的電子供體的方法，還原力強的樣品是良好的電子供應者，其供應的電子不僅能使Fe3+還原為Fe2+，也可以與自由基反應[24]。不同生長期藍莓葉醇提物的鐵還原力見圖2。從圖2中可以看出，不同生長期藍莓葉醇提取物（EEBL）的鐵還原能力隨著其質量濃度的提高而升高，當EEBL 的質量濃度在0.625～2.500 mg·g-1的范圍內，EEBL對Fe3+還原力的升高趨勢較為明顯，而當EEBL的質量濃度大于2.500 mg·mL-1后其增幅較小；當其質量濃度達到最高（10.000 mg·mL-1）時，VC的鐵還原能力大于嫩葉，除此之外，其他情況下嫩葉提取物的鐵還原力均大于其他生長時期藍莓葉及VC的還原力，在測定的濃度范圍內，5月EEBL 的鐵還原力與6、8、9月EEBL 的鐵還原力間存在顯著差異（P＜0.05）；6月和9月的鐵還原能力基本相當，總體大于8月藍莓葉醇提物的鐵還原能力，且在2.500～10.000 mg·mL-1的范圍內與8月藍莓葉醇提物間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 不同生長期藍莓葉醇提物的鐵還原力Fig.2 Reducing ability to Fe3+ of ethanol extraction of blueberry leaves during different growth periods

2.3 不同生長期藍莓葉醇提物清除DPPH 自由基能力的比較

DPPH 是一種穩定的自由基，廣泛用于測定生物試樣、酚類物質和食品的抗氧化能力，常用來評估抗氧化物的供氫能力[25]。不同生長期藍莓葉醇提物（EEBL）對DPPH 自由基的清除率見圖3。

圖3 不同生長期藍莓葉醇提物對DPPH 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging capability to DPPH radicals of ethanol extractions of blueberry leaves during different growth periods

由圖3可知，隨著藍莓葉醇提物的質量濃度的升高，其對DPPH 自由基的清除能力也升高，且在12.5～100.0 μg·mL-1的濃度范圍均有較好的劑量—效應關系，其相關系數R2均在0.94～0.99 之間，但當其質量濃度為100.0～200.0 μg·mL-1時，5月和6月采摘的藍莓葉EEBL 對DPPH 自由基的清除能力的變化趨勢均明顯，而8、9月采摘的藍莓葉醇提物及VC對DPPH 自由基的清除能力的增幅卻均變緩。在相同濃度下，總體上看，5、8 及9月此3 個生長時期采摘的藍莓葉EEBL 對DPPH 自由基的清除能力相當，而6月的相對較低，當EEBL 的質量濃度為50～200 μg·mL-1時，6月與其他生長時期及VC的清除率間呈顯著差異（P＜0.05）；當EEBL濃度最低（12.5 μg·mL-1）時，VC對DPPH 的 清除能力最弱，且其與所有生長期藍莓葉EEBL對DPPH 自由基的清除能力間均存在顯著差異（P＜0.05）。5、8 和9月采摘的藍莓葉其EEBL 的EC50值相當，分別為 （62.04±1.34）（63.12±1.38）（61.59±1.31）μg·mL-1，而6月的EC50值最大,為（96.31±2.08）μg·mL-1；4 個生長時期藍莓葉EEBL 的EC50值均大于對照品VC，VC對DPPH 自由基的EC50值為（57.46±1.20）μg·mL-1。

2.4 不同生長期藍莓葉總抗氧化能力的比較

測定總抗氧化能力的FRAP 法即“亞鐵還原能力實驗”，是一種在低pH 值的條件下利用亞鐵離子與TPTZ 生成藍紫色復合物來測量樣品抗氧化能力的實驗，廣泛運用于食品與保健品的抗氧化能力分析之中[23]。FRAP 值的大小代表著抗氧化能力的強弱，數值越大則說明抗氧化能力越強，不同生長期藍莓葉醇提物的FRAP 值見圖4。

圖4 不同生長期藍莓葉醇提物的總抗氧化能力（FRAP 值）Fig.4 Total antioxidant capacity (FRAP values) of ethanol extractions of blueberry leaves during different growth periods

由圖4可知，隨著藍莓葉醇提物質量濃度的提高，FRAP 值也逐漸增大，4 個生長期藍莓葉醇提物的FRAP 值均小于VC溶液的FRAP 值。在4 個生長期藍莓葉醇提物的FRAP 值中，9月的FRAP 值最大，6月的最小，當其醇提物的質量濃度在40～100 μg·mL-1的范圍內時，9月與6、8月的FRAP 值間均存在顯著差異（P＜0.05）。將9月的FRAP 值與5月的FRAP 值進行比較，當醇提物的質量濃度在低濃度范圍內時，兩者間存在顯著差異（P＜0.05）；而當醇提物的質量濃度在高濃度（80～100 μg·mL-1）范圍內時，兩者間的差異卻不顯著。5月嫩葉醇提物的FRAP值在其低濃度范圍內時小于6月和8月的；但當其在高濃度（80～100 μg·mL-1）范圍內時，其FRAP 值與6月和8月的FRAP 值間均存在顯著差異（P＜0.05）。但是，8月的FRAP 值總體上高于6月的FRAP 值。

3 討論與結論

隨著我國藍莓種植業的不斷發展，可利用的藍莓葉資源日益豐富。植物多酚是植物的次生代謝物，廣泛存在于植物體內，諸多研究結果都表明，藍莓葉多酚含量高于其果實和花[1-3,22]，因此，對藍莓葉的開發利用有利于提高藍莓種植業的經濟效益。隨著藍莓生長時間的延長藍莓葉中總黃酮、總酚的含量均逐漸升高，5月和6月的總酚含量基本相當，但果實采摘后藍莓葉中的總黃酮含量開始明顯升高，8月總黃酮含量為72.52 mg·g-1，顯著大于6月的總黃酮含量（52.72 mg·g-1），到9月可達96.76 mg·g-1，極顯著高于前3 個生長時期的。這與李曉英等人[22]對藍莓花與嫩葉、老葉中的總黃酮及總酚含量的比較研究結果基本吻合，藍莓花中的黃酮含量是多酚含量的2 倍多，而嫩葉中黃酮的含量是多酚的1.5 倍左右，老葉中的黃酮含量又接近多酚含量的2 倍。Routray 等[18]對兩個品種藍莓葉在不同生長期的多酚及花青素含量變化情況的研究結果也表明，5月二者的含量均較高，之后均降低，到9月才均基本回升到5月的含量水平。此研究結果表明，藍莓在從自然生長到成熟的過程中，葉片中的總酚、總黃酮含量均增加，且總黃酮含量高于總酚含量，總黃酮含量在藍莓成熟采摘之后迅速升高，老熟葉片中的總黃酮含量最多。這一結果說明，5月藍莓開花前，酚類代謝產物積累于藍莓葉中；花開和著果時，多酚和黃酮在花和果實中積累，且黃酮類物質的積累多于多酚類物質，這可能因為，藍莓葉中的酚類物質部分向花和果實中轉移，及至6—7月，高溫、氣體分壓低等不利生長環境造成這個時期藍莓葉次級代謝活動的減弱[26-27]，從而使得總酚類物質含量有所減少或持平，果實采摘后則開始增加。有關學者對忍冬葉[28]、桃樹葉[29]、桑葉[30]、山杏葉[31]等在不同生長期的生物活性物質的研究結果表明，6月采摘的忍冬葉其綠原酸等酚類物質的含量最高，桃樹嫩葉和9月底到10月初桃子采收后其葉片中的黃酮含量高，而桑葉中黃酮含量的變化不大，僅在10月后明顯下降；落葉期山杏葉中總三萜酸、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸等生物活性物質含量均高于非落葉期。徐友等人[32]的研究結果表明，2年生盆栽銀杏葉中黃酮類化合物的合成與增量存在顯著的光強效應和溫度、光強的交互效應。這一研究結果說明，酚類物質代謝及基因表達是一個復雜的過程，不同品種、不同栽培期及不同月份，園林植物葉片中的酚類物質含量均隨之變化。

不同生長期植物葉片的活性物質含量及抗氧化能力與植物品種有關，但其功能活性最高的時期均是在其花或果實采摘之后的一段時期。吳丹丹等[28]采用HPLC 法對不同生長期忍冬葉中的綠原酸、木犀草苷、蘆丁等9 種化合物的含量進行了測定，并對其抗菌活性進行了研究，結果表明，忍冬葉6月所測的各種活性成分含量均較高，且其抑菌效果最好，而6月正值忍冬花采摘（一般4、5月采摘）后的1 個月左右。本研究結果表明，不同生長期藍莓葉醇提取物提供電子的還原能力的大小順序為5月＞8月≈9月≈VC＞6月；其對DPPH 自由基的清除能力，6月的最低，其余3 個生長時期的均極顯著強于6月的，且與VC的相當；其總抗氧化能力即FRAP 值的大小順序為9月＞5月＞8月＞6月，均極顯著低于VC。由此說明，各生長期藍莓葉醇提取物對DPPH 自由基的清除能力均較強，而其還原能力均相對較弱，這與TURHAN 等人[12]的研究結果類似；Routray等人[21]的研究結果也顯示，不同季節藍莓葉對DPPH 自由基的清除能力和FRAP 值的大小順序均為10月＞9月＞5月＞7月，這與本研究結果也基本一致，說明藍莓葉的抗氧化活性受季節的影響，這可能是在不同的季節，環境條件的不同導致其次生代謝能力不同，其所生成的代謝物質的含量也不同，而活性物質的含量與其抗氧化能力間存在量效關系[33]。植物葉片中活性物質的含量不僅與其抗氧化能力有關，而且與植物葉片的抑菌及抗病力有關[34]。王明等人[35]通過調查、統計和分析，建立了9 種園林植物葉片的抗病蟲害能力與葉片中總多酚含量的關系的數學模型，結果表明，葉片中的多酚含量越高，其抗病蟲害能力就越強。

綜合不同季節藍莓葉醇提取物的酚類物質含量和抗氧化能力分析可知，開花期和著果期不適于藍莓葉的采摘及對其活性物質的利用，較適宜的采摘與利用時期應為9—10月，春梢上的藍莓葉盡管也有較高的酚含量和較強的功能活性，但不適于大量采摘。當然，本研究僅針對4～5 個月采摘的1 個品種的藍莓葉進行了探討，顯然存在一定的局限性，今后可對不同樹齡、不同品種在一年之內其葉片酚類物質的含量變化情況進行深入的研究。