共免疫對跳蚤叮咬引起的貓過敏性皮炎保護效果評價

趙 兵，溫良海，劉正偉，王 瀚，張愛國，李慧敏，李延鵬，陳瑞愛,*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東新興 527400)

貓桎首蚤分布很廣，寄生于動物體表，以吸血為生，是對犬貓造成嚴重危害的蚤類。跳蚤過敏性皮炎(Flea allergy dermatitis, FAD)是由跳蚤叮咬吸血時引起動物的皮炎、劇烈瘙癢以及抓撓導致的二次感染的過敏性皮膚病[1]。因此，對貓桎首蚤的防控及其導致的過敏性皮炎的防治顯得尤為重要。

人們針對跳蚤叮咬引起犬貓過敏性皮炎的防治方法有多種。首先利用殺蟲劑、寵物香波等進行動物除蚤，然后采用藥浴、涂抹激素類藥物等對癥治療，雖能取得一定的療效，但是這種方法存在療效差、激素類藥物副作用大等缺點，而且當跳蚤侵擾時不能阻止跳蚤過敏性皮炎再次發生[2]。也有人嘗試免疫脫敏療法，該方法通過反復接種過敏原，提高患病動物對變應原的耐受性，當動物再次接觸過敏原時，機體會大大減少炎癥介質的釋放，從而減輕過敏性皮炎的發病程度，但該方法缺點是療程長，可能會造成動物皮膚損傷甚至導致過敏性休克，效率也不穩定，重復性低[3-4]。

研究表明，過敏性疾病的發生與Th1向Th2漂移，Th2處于優勢地位有關[5]。調節性T細胞可以通過細胞因子網絡影響Th1、Th2的平衡[6]，對防止自身免疫性疾病發生，限制慢性炎癥等具有重要作用[7]。共免疫rFSA1和與之編碼相匹配的質?？梢哉T導一群誘導性調節性T細胞(iduced Treg, iTreg)，能夠改善鼠和貓FAD的癥狀[8-9]。為了解共免疫能否有效預防過敏性疾病，研究評價了共免疫對貓FAD的預防保護效果。

1　材料與方法

1.1貓和跳蚤45只年齡大于12個月、體重超過2 kg的同一品種家貓，購自北京市興隆實驗動物養殖廠；貓桎首蚤，由中國疾病預防控制中心提供。

1.2試劑與儀器pET28a載體、pVAX1載體購自淼靈生物科技(武漢)有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受態細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ，DNA連接酶, DL2000 DNA Marker,DL15000 DNA Marker蛋白質分子質量標準，質粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；脂質體轉染試劑購自北京雷根生物技術有限公司；Ni-NTA親合層析柱填料購自北京諾博萊德科技有限公司；Biosafer150-96超聲波細胞破碎儀購自賽飛(中國)有限公司；NanoDrop?Lite紫外分光光度計購自北京蘭博康斯科技有限公司；諾普星購自諾華動物保健(上海)有限公司；鱟試劑購自湛江博康海洋生物有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3FSA1基因與引物的設計合成FSA1基因與引物均由上海生工生物工程有限公司合成。參照GenBank數據庫發表的FSA1基因序列(登錄號為AF102502)，設計擴增FSA1基因的引物P1、P2和P3，核酸序列如下P1：5'-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3'；P2：5'-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3'；P3：5'-GCCTCTAGATTATTTATTTTTTGG-3'。P1為上游引物，帶有EcoRⅠ酶切位點；P2、P3為下游引物，分別帶有XhoⅠ、XbaⅠ酶切位點。

1.4FSA1基因的克隆

1.4.1原核表達質粒的構建及鑒定以人工合成的FSA1基因為模板，以P1、P2為引物，PCR擴增基因片段，克隆至原核表達載體pET28a，并轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，涂布于LB卡那抗性平板，挑取單菌落，EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切并測序鑒定，將鑒定正確的原核表達質粒命名為pET28a- FSA1,重組菌命名為BL-FSA1。

1.4.2真核表達質粒的構建及鑒定以P1、P3為引物，PCR擴增基因片段，克隆至真核表達載體pVAX1，并轉化E.coliDH5α感受態細胞，涂布于LB卡那抗性平板，挑取單菌落，EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切并測序鑒定，將鑒定正確的重組菌命名為DH-FSA1。鑒定成功的pVAX1-FSA1參照脂質體轉染試劑盒說明書轉染BHK細胞，72 h后收集細胞，提取細胞總RNA，RT-PCR鑒定pVAX1-FSA1在真核細胞中的表達。

1.5共免疫疫苗的制備

1.5.1rFSA1蛋白制備與純化將重組菌BL-FSA1接種于含有卡那霉素的LB液中培養，待OD600值達到0.6～0.8時，將菌液分為4組，其中3組分別以0.1、0.5、1.0 mmol/L IPTG濃度誘導，另一組不誘導作為對照，用SDS-PAGE法分析4 h后重組蛋白表達量。收集誘導表達的菌體，冰浴條件下進行超聲波破碎，以10000 r/min離心包涵體15 min，取上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析。

收集包涵體，用8 mol/L脲過夜攪拌溶解包涵體，離心取上清液，通過Ni-NTA親和層析柱分離目的蛋白，洗脫液(8 mol/L脲、300 mmol/L KCl、50 mmol/L KH2PO4、500 mmol/L咪唑、pH8.0)洗脫目的蛋白FSA1，重組蛋白：0.5 mol/L精氨酸以1∶20(V∶V)比例稀釋復性，置于透析袋中透析36 h，每12 h更換一次透析液(PBS)。利用曲拉通去除內毒素，將10%曲拉通X-114按1∶4體積比與rFSA1/PBS混勻，冰浴10 min，然后37 ℃水浴15 min，10000 r/min離心15 min，吸出上層液，重復以上步驟3次，按照鱟試劑使用說明書檢測溶液內毒素。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度后，于-70 ℃保存。

1.5.2真核表達質粒pVAX1-FSA1的制備將重組菌DH-FSA1接種于含有卡那霉素的LB液中，37 ℃過夜培養，按照文獻[7]所述方法制備質粒pVAX1-FSA1。去除質粒溶液內毒素并檢測內毒素含量。用紫外分光光度計測定濃度，于-70 ℃保存。

1.6免疫效力評價45只貓隨機分為5組。共免疫組每只免疫500 μg rFSA1蛋白+500 μg pVAX1-FSA1質粒，載體對照組每只免疫500 μg rFSA1蛋白+500 μg pVAX1空載體；蛋白對照組每只免疫500 μg BSA蛋白+500 μg pVAX1-FSA1質粒，于腿部肌肉注射。二免后14 d開始攻跳蚤，每只貓每輪攻100只跳蚤(新羽化未吸血的成蚤)，每次攻跳蚤48 h后，飼喂諾普星(有效成分：烯啶蟲胺)除蚤，間隔12 d后開始下一輪攻蚤，總共攻4輪(攻4輪跳蚤后貓FAD皮炎評分能達到最高值，額外的輪數并不會增加皮炎評分分值)[6]。FAD對照組不免疫，采用相同的步驟攻4輪跳蚤和飼喂除蚤藥?？瞻讓φ战M既不免疫也不攻跳蚤，但是飼喂諾普星作為陰性對照。由專業的獸醫人員給貓皮炎癥狀打分，評價共免疫對貓FAD的保護效果。實驗在跳蚤活躍季節夏、秋季實施，所有貓飼養在鐵籠里，籠具長90 cm、寬63 cm、高82 cm，每日打掃貓的排泄物，給予干凈的水和貓糧，以提供舒適的環境?？瞻讓φ战M貓在隔壁籠舍飼養，所有籠舍通風良好。貓實驗分組情況見表1。

表1　貓實驗免疫分組Tab 1　Dividing cats into five groups

“-”代表不操作

"-" on behalf of not operating

FAD癥狀主要包括丘疹、結痂、脫毛。每種皮損評分從0分至3分：0分-沒有發病癥狀；1分-發病程度輕微；2分-中等程度的發病；3分-發病程度嚴重。各種皮損計分標準：丘疹1～3個計1分，4～6個計2分，7個及以上計3分；脫毛面積大于或等于1 cm2且小于4 cm2計1分，大于或等于4 cm2且小于9 cm2計2分，大于或等于9 cm2計3分；結痂1個計1分，2個計2分，3個及以上計3分。有3個部位的癥狀需要被觀察：(1)頸背部，從頭頂到尾部的區域；(2)胸腔側：從近肘部的胸腔到最后一根肋骨出的區域；(3)跳蚤三角區，動物下腹部和兩條后肢根部組成的一個三角區。

關于皮炎計分標準是依據文獻[9]所述方法進一步細化得出的量化計分標準，有助于方便、準確評估FAD發病程度。

2　結　果

2.1FSA1基因的克隆及鑒定結果FSA1基因與原核表達載體pET28a連接后構建pET28a-FSA1，質粒經EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切可產生5400 bp左右的空載體條帶和一條480 bp的目的條帶(圖1)；FSA1基因與真核表達載體pVAX1連接構建pVAX1- FSA1，質粒經EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切可產生3000 bp左右的空載體條帶和一條480 bp的目的條帶(圖2)。pET28a-FSA1與pVAX1-FSA1測序鑒定結果與預期相符。將pVAX1-FSA1轉染BHK細胞，采用RT-PCR法測定重組質粒在BHK細胞中的表達，結果表明重組質粒pVAX1-FSA1轉染后能在BHK細胞中穩定表達(圖3)。

M1: DL15000 bp DNA Marker;M2: DL2000 bp DNA Marker；1：重組質粒pET28a-FAS1；2：重組質粒 EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切產物M1: DL15000bp DNA Marker; M2: DL2000bp DNA Marker;1: recombinant plasmid pET28a-FSA1; 2: The product from recombinant plasmid pET28a-FSA1 digested with EcoRⅠ+XhoⅠ圖1　重組表達質粒pET28a-FSA1的雙酶切鑒定Fig 1　Double restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pVAX1-FSA1

M1: DL15000 bp DNA Marker; M2: DL2000 bp DNA Marker；1：重組質粒pVAX1-FAS1；2：重組質粒EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切產物M1: DL15000bp DNA Marker; M2: DL2000bp DNA Marker;1: recombinant plasmid pVAX1-FSA1; 2: The product from recombinant plasmid pET28a-FSA1 digested with EcoRⅠ+XbaⅠ圖2　重組表達質粒pVAX1-FAS1的雙酶切鑒定Fig 2　Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pVAX1-FSA1

M: DL2000 DNA Marker；1：轉染的BHK細胞中表達的FSA1基因；2：未轉染的BHK細胞M: DL2000 DNA Marker; 1: Transfected BHK cells express the FSA1 gene；2: untransfected BHK cells圖3　FSA1基因的RT-PCR鑒定Fig 3　Identification of FSA1 gene by RT-PCR

2.2共免疫疫苗的制備

2.2.1蛋白制備重組菌BL-FSA1經IPTG誘導后用SDS-PAGE檢測，結果表明在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG的條件下誘導4 h能大量表達重組蛋白rFSA1，更高濃度的IPTG并不會增加目的蛋白的表達量(圖4)。

M：未預染的蛋白質分子質量標準；1：pET28a未經IPTG誘導；2：pET28a-FSA1未經IPTG誘導；3：pET28a-FSA1經0.1 mmol/L IPTG誘導；4：pET28a-FSA1經0.5 mmol/L IPTG誘導；5：pET28a-FSA1經1.0 mmol/L IPTG誘導M: Unstained protein molecular weight Marker; 1: pET28a without induction with IPTG; 2: pET28a-FSA1 without induction with IPTG;3: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 0.1 mmol/L;4: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 0.5 mmol/L;5: pET28a-FSA1 induction with IPTG at 1.0 mmol/L圖4　FSA1基因誘導表達IPTG濃度的優化Fig 4　Determination of induction IPTG concerntration for FSA1 gene

收集裂解菌離心后的上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE，可溶性分析表明rFSA1主要以包涵體形式存在；重組蛋白溶液通過曲拉通去除內毒素后，經鱟試劑檢測內毒素含量<1.25 EU/mL；重組蛋白溶液經BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度為0.5 mg/mL。

2.2.2質粒制備將按照文獻[10]中方法提取的質粒通過曲拉通去內毒素后，鱟試劑檢測其內毒素含量<1.25 EU/mL，質粒溶液經紫外分光光度計測定濃度為1.5 mg/mL。

2.3皮炎評分結果對各組貓每次攻跳蚤后第3天給貓進行FAD癥狀打分,計算丘疹、脫毛、結痂各種皮炎總分。隨著各組攻跳蚤的次數增多，貓出現多處丘疹，結痂，脫毛等臨床病癥，引起了嚴重的過敏性皮炎。FAD對照組(5.5分)在第4次攻跳蚤后皮炎評分達到最高值，它與載體對照組(5.7分)和蛋白對照組(5.3分)得分接近。共免疫組第4次攻跳蚤后皮炎評分為1.9分，與FAD對照組、載體對照組和蛋白對照組相比分值明顯減小(圖5)。以上結果說明對照組rFSA1+pVAX1和BSA+pVAX1-FSA1對貓FAD沒有影響或影響較小。而共免疫rFSA1+pVAX1-FSA1能顯著抑制貓FAD，因此可以成為預防貓FAD的候選疫苗。圖6為貓FAD發病的典型癥狀。

圖5　各組實驗貓皮炎總評分Fig 5　The total dermatology scores of five groups

圖6　貓FAD的典型癥狀Fig 6　Typical symptoms of FAD in cats

3　討　論

調節性T細胞是一類具有調節其他免疫細胞功能的T細胞亞群。調節性T細胞有多種免疫調節機制，其中最重要的一種是通過分泌細胞因子發揮調節作用。研究人員發現共免疫可以誘導機體產生一群CD4+CD25-Foxp3+Treg，這群iTreg具有對特異性抗原的反應性，分泌IL-10和TGF-β等抑制性細胞因子，抑制炎癥T細胞[8]。靳津在治療貓FAD的實驗中進一步證明了共免疫可以減弱貓對跳蚤提取物皮試反應、減少組織中肥大細胞的聚集和抑制T細胞增殖，這與機體中過敏相關細胞因子IL-5的分泌減少，抑制性細胞因子IL-10的分泌增加有關，從而改善了跳蚤過敏性皮炎的癥狀[9]。除了細胞因子途徑以外，Treg還可以通過細胞溶解、代謝阻斷、調節樹突狀細胞的成熟或功能發揮抑制作用。但目前尚不清楚共免疫誘導的iTreg調節免疫抑制是否有多種機制共同作用。據此推測，利用共免疫預防保護貓FAD具有上述類似的抑制機理。

在觀察貓FAD發病情況時發現，即使在相同的環境下誘導FAD，貓FAD的發病程度也會存在差異。為了說明試驗中貓的發病程度，將FAD對照組皮炎評分分值劃為4個檔次：0分為不發??；1～3分為發病輕微；4～6分為中度發??；6～9分為嚴重發病。FAD對照組在攻完4輪跳蚤后有6只貓嚴重發病，有1只中度發病，有2只發病輕微，甚至還有1只沒有任何癥狀，說明FAD組貓發病程度的差異較大與貓對跳蚤的敏感性存在個體差異有關，即有的貓被少量跳蚤叮咬就能引起劇烈瘙癢，產生明顯的病癥，但有的貓即使感染了大量跳蚤只表現出輕微病癥甚至不發病。因此，人為誘導貓FAD發病是存在個體差異的，這與Wilkerson誘導犬FAD的發病程度存在差異的情況類似[11]。

攻跳蚤和皮炎評分方法首先是由Wilkerson等[11]建立并用于評價犬FAD發病程度，后來靳津等[9]將這種方法優化后用于評價共免疫對貓FAD的治療效果。試驗證明按照同樣的方法能成功誘導貓FAD并進行皮炎評分，通過四輪攻跳蚤后皮炎評分達到最高值，該模型可以對共免疫預防貓FAD的效果進行客觀評定。靳津通過建立貓FAD模型后，利用共免疫治療貓FAD，皮炎評分迅速下降，取得了顯著治療效果。通過預先共免疫，再進行誘導貓FAD，皮炎評分只是略微增加，遠遠小于FAD對照組的皮炎評分，證明了共免疫重組蛋白rFSA1+質粒pVAX1-FSA1對貓FAD具有顯著的預防保護效果。為了排除其他DNA和蛋白質組合誘導非特異性免疫抑制的可能性，試驗增加了免疫rFSA1+pVAX1、BSA+pVAX1-FSA1的貓作為載體對照組和蛋白對照組，結果表明免疫非相關組合rFSA1+pVAX1、BSA+pVAX1-FSA1對貓FAD沒有保護效果,只有共免疫rFSA1+pVAX1-FSA1才能對貓FAD起到保護作用，體現了該候選疫苗的特異性。然而共免疫組(1.9分)與空白對照組(0.4分)相比，仍有輕微的皮炎癥狀，這可能與免疫方式或免疫劑量有關。此次試驗中，貓是每14 d免疫1次，共免疫2次，每次500 μg BSA+500 μg pVAX1-FSA1于腿部肌肉注射，下一步可通過改進免疫方式、免疫劑量以期得到更好的保護效果。

試驗表明利用共免疫生物制劑預防跳蚤過敏性皮炎能取得較好的預防效果，具有操作方便、療程短的優點，且無副作用，是一個安全性高、具有抗原特異性的方法，作為候選疫苗具有良好的開發應用前景，但如何提高共免疫的預防保護效果還需進一步研究。

參考文獻：

[1]麻 毅, 姜志寬, 韓招久. 跳蚤的危害及防治研究進展[J]. 中華衛生殺蟲藥械, 2004, 10(6): 385-388.

Ma Y, Jiang Z K, Han Z J. Harm of fleas and its control develop￣ment[J]. Chinese Journal of Hygienic Insecticides of Equipments, 2004, 10(6): 385-388.

[2]林德貴. 犬貓皮膚病[C]// 第十一屆全國養犬學術研討會論文集. 南昌：公安部南昌警犬基地. 2005.

Lin D G. Skin disease in cats and dogs[C]//Proceedings of the 11th National Kennel Symposium. Nanchang：Ministry of Public Security Nanchang Police Dog Base. 2005.

[3]早崎峰夫，王振杰. 犬過敏性皮炎的自制蚤變應原脫敏療法[J]. 國外獸醫學(畜禽疾病), 1995, 16(1): 20-23.

Zaoqi F F, Wang Z J. The desensitization therapy for home-made fleas allergen on allergic dermatitis in dogs[J]. Progress In Veterinary Medicine, 1995, 16(1): 20-23.

[4]魏 瓊. 脫敏療法的機制研究[J]. 大家健康, 2013,(17): 206.

Wei Q. The mechanism study of desensitization therapy[J]. For Our Health, 2013, (17): 206.

[5]姚金晶, 陳宜濤. Th1/Th2平衡調節與疾病發生的研究進展[J]. 生物磁學, 2009, 9(13): 2597-2600.

Yao J J, Chen Y T. Advances of regulation Th1/Th2 type cytokines balance in human diseases[J]. Biomagnetism, 2009, 9(13): 2597-2600.

[6]肖玲莉，楊 毅. Th1/Th2免疫應答失衡及其影響因素[J]. 國際兒科學雜志, 2006, 33(6): 399-402.

Xiao L L, Yang Y. The development of Th1/Th2 immune response disequilibrium and the influential factors[J]. International Journal of Pediatrics, 2006, 33(6): 399-402.

[7]程愛榮, 程 焱, 孫保亮. 調節性T細胞及其免疫抑制機制[J]. 中國臨床神經科學, 2014, 22(4): 438-444.

Cheng A R, Cheng Y, Sun B L. Regulatory T cells and its mechanism of immunosuppression[J]. Chinese Journal of Clinical Neurosciences, 2014, 22(4): 438-444.

[8]Jin H, Kang Y, Zhao L,etal. Induction of adaptive T regulatory cells that suppress the allergic response by coimmunization of DNA and protein Vaccines[J]. The Journal of Immunology, 2008, 180: 5360-5372.

[9]Jin J, Ding Z, Meng F X,etal. An immunotherapeutic treatment against flea allergy dermatitis in cats by co-immunization of DNA and protein vaccines[J]. Vaccine, 2010, 28(8): 1997-2004.

[10] 謝振華, 史小軍, 蔡國平. 用于哺乳動物細胞轉染的高純度質粒DNA的制備[J]. 生物技術通訊, 2007, 18(5): 803-805.

Xie Z H, Shi X J, Cai G P. The preparation of highly purified plasmid DNA for mammalian cell transfections[J]. Letters In Biotechnology, 2007, 18(5): 803-805.

[11] Wilkerson Melinda J, Bagladi-Swanson Mary, Wheeler David W,etal. The immunopathogenesis of flea allergy dermatitis in dogs, an experimental study[ J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2004, 99(3/4): 179-192.