HPLC-ELSD法聯(lián)合UPLC-MS/MS法檢測(cè)魚(yú)腥草注射液中非法添加的慶大霉素

王靜文，龔旭昊，范 強(qiáng)*，孫 雷，汪 霞

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

魚(yú)腥草注射液為魚(yú)腥草經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功能[1]，在中獸醫(yī)臨床具有廣泛應(yīng)用。然而，近兩年來(lái)已先后在魚(yú)腥草注射液中發(fā)現(xiàn)有非法添加甲氧氯普胺、林可霉素、水楊酸、氧氟沙星[2-4]等化學(xué)藥品的現(xiàn)象，最近又在一批委托檢驗(yàn)樣品中檢出慶大霉素。這種在處方外非法添加化學(xué)藥品的現(xiàn)象不僅嚴(yán)重威脅了動(dòng)物用藥安全，擾亂了獸藥市場(chǎng)，也給動(dòng)物源性食品安全帶來(lái)了隱患。慶大霉素是一種氨基糖苷類(lèi)廣譜抗生素，主要用于治療細(xì)菌感染，尤其是革蘭陰性菌引起的感染[5]。分析慶大霉素常見(jiàn)的方法有微生物法、熒光免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法等，其中僅有色譜技術(shù)能定量慶大霉素中各組分的含量。目前尚未有應(yīng)用UPLC-MS/MS檢測(cè)獸藥中非法添加慶大霉素的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次建立了HPLC-ELSD聯(lián)合UPLC-MS/MS系統(tǒng)篩查魚(yú)腥草注射液中慶大霉素的方法，以期為相關(guān)工作提供技術(shù)支持。

1　儀器與材料

1.1儀器SHIMADZU高效液相色譜儀SPD-20A(日本島津公司)、Alltech ELSD 2000ES、Waters Acquity超高效液相色譜(美國(guó)Waters公司)、Waters Quattro Premier XE(美國(guó)Waters公司)、Masslynx工作站軟件(美國(guó)Waters公司)、 Mettler XS205型十萬(wàn)分之一天平(美國(guó)Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機(jī)。

1.2試藥與試劑慶大霉素對(duì)照品(C1a：27.8%，C2：24.6%，C2a：22.0%，C1：25.7%，批號(hào)：K0071502，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。供試品：魚(yú)腥草注射液空白樣品(批號(hào)：150303)，魚(yú)腥草注射液陽(yáng)性樣品(批號(hào)：2015122611)。乙腈(Merck，色譜純，批號(hào)：1747130433)，甲醇(Merck，色譜純，批號(hào)：1748007433)，甲酸(Fisher Scientific，色譜純，批號(hào)：106055A)，七氟丁酸酐(HFBA，Alfa Aesar，色譜純，10132012)，三氟醋酸(Fisher Scientific，色譜純，135262)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2　方　法

2.1溶液制備

2.1.1HPLC-ELSD用魚(yú)腥草注射液樣品溶液制備

取魚(yú)腥草注射液樣品1.0 mL，置錐形瓶中，加0.2 mol/L三氟醋酸-甲醇(92∶8)稀釋至50 mL，搖勻；過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.1.2UPLC-MS/MS用魚(yú)腥草注射液樣品溶液制備取魚(yú)腥草注射液樣品1.0 mL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；取200 μL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；過(guò)0.22 μm濾膜，即得。

2.1.3HPLC-ELSD用慶大霉素對(duì)照品溶液制備取慶大霉素對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加0.2 mol/L三氟醋酸-甲醇(92:8)溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4UPLC-MS/MS用慶大霉素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液取慶大霉素對(duì)照品38.9 mg(相當(dāng)于慶大霉素C110.0 mg)，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。配制完后轉(zhuǎn)移至塑料離心管內(nèi)于4 ℃冰箱保存，有效期為1個(gè)月。

2.1.5UPLC-MS/MS用慶大霉素對(duì)照品工作溶液

取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；取100 μL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。配制完后轉(zhuǎn)移至塑料離心管內(nèi)于4 ℃冰箱保存。

2.1.65 mmol/L七氟丁酸酐溶液取0.25 mL HFBA，加水稀釋至200 mL，搖勻，即得。

2.2儀器條件

2.2.1HPLC-ELSD色譜條件色譜柱：資生堂MG C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.2 mol/L三氟醋酸 -甲醇(92∶8)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL ，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD，漂移管溫度110 ℃，載氣流量2.8 L/min)。

2.2.2UPLC色譜條件色譜柱：Waters C18(2.1×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液(10∶90)，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.3質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI+)；離子源溫度為110 ℃；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓為3.2 kV；霧化氣溫度為350 ℃；霧化氣流速為650 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣體為氬氣。慶大霉素C1的定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量參考值見(jiàn)表1。

表1　慶大霉素C1定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓、碰撞能量參考值Tab 1　Mass spectrometry detection conditions of Gentamicin C1

3　結(jié)果與分析

3.1非法添加物的發(fā)現(xiàn)及初步分析某單位在獸藥監(jiān)督工作中發(fā)現(xiàn)一批魚(yú)腥草注射液樣品中疑似添加有慶大霉素，由于技術(shù)條件有限，委托予以確認(rèn)。由于慶大霉素分子結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛雙鍵，無(wú)紫外吸收，無(wú)法采用常規(guī)的HPLC-PDA方法進(jìn)行初篩，故參考《中國(guó)獸藥典》一部硫酸慶大霉素檢查項(xiàng)下慶大霉素C組份的HPLC-ELSD測(cè)定方法進(jìn)行初篩，色譜條件參見(jiàn)2.2.1項(xiàng)，溶液的配制參見(jiàn)2.1.1和2.1.3項(xiàng)，發(fā)現(xiàn)這批魚(yú)腥草注射液樣品在與慶大霉素對(duì)照品四個(gè)組份相應(yīng)位置出現(xiàn)相同色譜峰，且四個(gè)組份的含量比例接近，進(jìn)一步確定，此樣品中添加有慶大霉素(圖1～圖2)。

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立針對(duì)此批樣品的UPLC-MS/MS的慶大霉素檢查方法，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。

圖1　慶大霉素對(duì)照品(1 mg/mL)色譜圖(依次為慶大霉素C1a、C2、C2a、C1)Fig 1　Chromatogram of Gentamicin(1 mg/mL)(Gentamicin C1a、C2、C2a、C1)

圖2　魚(yú)腥草注射液色譜圖(依次為慶大霉素C1a、C2、C2a、C1)Fig 2　Chromatogram of Houttuynia Injection (Gentamicin C1a、C2、C2a、C1)

3.2UPLC-MS/MS方法學(xué)考察

3.2.1專(zhuān)屬性通過(guò)溶劑空白試驗(yàn)和魚(yú)腥草注射液空白試驗(yàn)排除溶劑及制劑處方中主要成分對(duì)于被測(cè)物的干擾。精密量取5 mmol/L七氟丁酸酐溶液、魚(yú)腥草注射液空白溶液、慶大霉素對(duì)照品溶液(相當(dāng)于慶大霉素C11 μg/mL)10 μL，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件，注入U(xiǎn)PLC-MS/MS，記錄特征離子質(zhì)量色譜圖，結(jié)果表明5 mmol/L七氟丁酸酐、魚(yú)腥草注射液本底對(duì)慶大霉素C1檢測(cè)無(wú)干擾(圖3～圖5)。

圖3　5 mmol/L七氟丁酸酐溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3　Characteristic ions mass spectrometry of HFBA (5 mmol/L)

圖4　魚(yú)腥草注射液空白溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 4　Characteristic ions mass spectrometry of sample blank

圖5　慶大霉素C1對(duì)照品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 5　Characteristic ions mass spectrometry of Gentamicin C1

3.2.2線性取慶大霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液(相當(dāng)于慶大霉素C11.0 mg/mL)150 μL置10 mL容量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為15 μg/mL的慶大霉素C1對(duì)照品溶液；精密量取上述溶液1、3、5、7、9 mL置100 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.15、0.45、0.75、1.05、1.35 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件測(cè)定。按慶大霉素C1定量離子峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。慶大霉素C1回歸方程為y=5519.3x+879.24，R=0.9965。表明慶大霉素C1在0.15～1.35 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

3.2.3檢測(cè)限添加適量慶大霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液至1.0 mL魚(yú)腥草注射液空白樣品中，按2.1.2項(xiàng)同法處理，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件測(cè)定，觀察慶大霉素C1特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N>3作為方法的檢出限。取魚(yú)腥草注射液空白樣品1.0 mL三份，置刻度管中，分別加入慶大霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液(相當(dāng)于慶大霉素C11.0 mg/mL)適量(100、150、200 μL)，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；取200 μL，置刻度管中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至10 mL，搖勻；過(guò)0.22 μm濾膜，精密吸取上述檢測(cè)限樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件測(cè)定檢測(cè)限，結(jié)果表明中間加入量為慶大霉素C1的檢測(cè)限為0.15 g/L。

3.2.4準(zhǔn)確度及精密度以魚(yú)腥草注射液空白樣品加慶大霉素對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度。回收率試驗(yàn)溶液配制：取魚(yú)腥草注射液空白樣品1.0 mL、慶大霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液(相當(dāng)于慶大霉素C11.0 mg/mL)750 μL，置同一10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；取200 μL，置10 mL量瓶中，加5 mmol/L七氟丁酸酐溶液稀釋至刻度，搖勻；過(guò)0.22 μm濾膜，平行配制上述試驗(yàn)溶液各6份。精密吸取上述試驗(yàn)溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件檢測(cè)。結(jié)果顯示：魚(yú)腥草注射液中慶大霉素C1回收率為97.7%，RSD為5.5%。

3.3樣品測(cè)定結(jié)果參考?xì)W盟2002/657/EC中有關(guān)規(guī)定，樣品溶液色譜圖中如出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的峰(差異小于等于±2.5%)，定性離子對(duì)與對(duì)照品一致(表1)，特征離子豐度比與對(duì)照品溶液一致(偏差符合表2的要求)，計(jì)算樣品中慶大霉素C1的濃度，如大于檢測(cè)限，判定為檢出慶大霉素。取魚(yú)腥草注射液待測(cè)樣品照2.1.2項(xiàng)制備方法操作，照2.2.2和2.2.3項(xiàng)液相質(zhì)譜條件測(cè)定慶大霉素，結(jié)果為：魚(yú)腥草注射液中慶大霉素C1含量為0.86 g/L，陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　離子豐度比的最大允許偏差Tab 2　Maximum permitted tolerances for relative ion intensities

表3　陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果Tab 3　Result of the sample

4　討論與小結(jié)

4.1篩查思路的選擇目前非法添加物篩查工作總體上可分為無(wú)目標(biāo)篩查和有目標(biāo)篩查兩種。無(wú)目標(biāo)篩查主要是針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的非法添加物，借助色譜光譜質(zhì)譜核磁等[6]分析手段，結(jié)合合理的臨床藥理依據(jù)，推導(dǎo)出可能的化合物結(jié)構(gòu)及名稱(chēng)；有目標(biāo)篩查是指在各實(shí)驗(yàn)室已積累的非法添加物數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上，對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)中收載的化合物篩查，常見(jiàn)的方法有液相色譜-二極管陣列法(HPLC-PDA)[7]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等(HPLC-MS/MS)[8]。本研究屬于有目標(biāo)篩查范圍，由于慶大霉素結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，無(wú)紫外吸收，無(wú)法采用HPLC-PDA法進(jìn)行篩查，同時(shí)由于慶大霉素為多組分化合物，建立包含各組分的質(zhì)譜分析方法工作量大且無(wú)必要，故先采用HPLC-ELSD法對(duì)樣品進(jìn)行初篩，首先明確樣品是否添加有慶大霉素，再選取慶大霉素主要成分之一慶大霉素C1，建立相應(yīng)的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。

4.2UPLC-MS/MS測(cè)定溶劑、流動(dòng)相的選擇由于慶大霉素在水中易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶[9]，故選擇水作為對(duì)照品溶劑。在無(wú)離子對(duì)情況下，慶大霉素在C18硅膠柱上無(wú)保留，在流動(dòng)相中添加20 mmol/L七氟丁酸酐溶液后，情況改善，保留時(shí)間為6.1min，但這類(lèi)抑制劑會(huì)抑制離子化，污染LC/MS表面，減低儀器靈敏度，故本研究嘗試以5 mmol/L七氟丁酸酐溶液代替水作為對(duì)照品儲(chǔ)備液和樣品的稀釋溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)既可改善慶大霉素?zé)o保留情況，又可降低對(duì)儀器的損害。

4.3溶液儲(chǔ)存條件的選擇氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)極性表面有非常高的吸附親和力，所以容量瓶、樣品瓶等試驗(yàn)用具應(yīng)盡量選擇吸附性弱的材質(zhì)，玻璃和其他吸附性強(qiáng)的塑料制品均會(huì)對(duì)慶大霉素產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸附作用，導(dǎo)致樣品的損失，在溶液儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量避免[10-13]。慶大霉素在酸性水溶液和堿性水溶液中均穩(wěn)定，其水溶液在4～8 ℃可以保存六個(gè)月[11]。

本文建立了一種系統(tǒng)篩查魚(yú)腥草注射液中非法添加慶大霉素的篩查方法，結(jié)合了液相色譜操作簡(jiǎn)單普及率高和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜準(zhǔn)確靈敏的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步完善了非法添加檢測(cè)工作中有目標(biāo)篩查板塊的技術(shù)儲(chǔ)備。該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，可廣泛應(yīng)用于非法添加檢測(cè)工作。

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