納米技術提高抗菌藥物治療胞內菌感染的研究進展

周凱翔，李 超，王曉芳，謝書宇*

(1.國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)/國家獸藥安全評價實驗室/農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室，華中農業大學，武漢 430070；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定 071000)

目前，專性和兼性胞內病原菌(立克次體、衣原體、金黃色葡萄球菌、胞內勞森菌、布氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌、麻風桿菌、嗜肺軍團菌)能通過自身特定的生存策略或者毒素透化細胞膜進入細胞，引起慢性和持續性感染，給畜牧業生產造成了巨大的經濟損失，嚴重阻礙了畜牧業經濟的健康發展。據不完全統計，在世界范圍內每年約有5000萬頭牛感染結核，年均直接經濟損失達30億美元[1]。奶牛乳腺炎在我國的發病率為20%～70%左右，其中隱性乳腺炎的發病率高達70%，以金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的發病率和危害最為嚴重。據權威統計，胞內勞森菌引起的豬增生性腸炎(PPE)在美國每年造成的損失高達2000萬美元。

常規抗菌藥物因不能有效進入宿主細胞、胞內蓄積能力弱、活性降低或喪失等原因在胞內感染靶位達不到有效的治療濃度和時間[2-4]，造成胞內感染性疾病治療面臨具大的難題和挑戰。且長時間的亞治療劑量還易誘導細菌耐藥性的產生。因此，胞內感染疾病的治療難題成為了藥物學和獸醫工作者的研究焦點和熱點。近些年來，研究發現納米抗菌藥物可以通過淋巴轉運和炎性部位毛細血管的滲透增強作用輸送到感染的靶部位和靶細胞[5]。納米藥物到達感染部位后，可以通過膜融合、內吞、膜裂縫通道等多種途徑和方式被攝入感染細胞[6-7]，從而提高抗菌藥物在細胞內的濃度和維持有效濃度的時間，顯著提高了胞內感染的治療效果，為突破畜禽胞內感染性疾病的治療難題提供新的途徑。本文就納米抗菌藥物治療胞內感染性疾病的有效性、優效性、治療研究進展和面臨的挑戰進行了系統的總結和分析，以便為未來的研究提供思路，加快納米技術在胞內感染性疾病治療的應用研究進程，為畜禽胞內菌感染性疾病治療提供高效的獸藥產品。

1　胞內感染性疾病治療面臨的難題

專性和兼性胞內菌能通過特定的侵襲機制或者毒素透化細胞膜進入細胞。如圖1所示，金黃色葡萄球菌可以先通過β-毒素將細胞膜外層親水性磷酸膽堿水解暴露出疏水性神經酰胺結構，再由δ-毒素透化疏水部分從而穿透細胞膜進入細胞；沙門氏菌在被細胞吞噬體吞噬后，其可以在吞噬小泡中存活下來，從而在細胞內定居。此外，某些專性或兼性胞內病原菌產生細菌毒素和靶向于宿主細胞膜的表面蛋白，或者合成效應蛋白進入宿主細胞的細胞核并改變“組蛋白密碼”，誘導宿主細胞DNA甲基化模式的改變，引起宿主細胞的表觀遺傳變化和基因表達模式的改變，抑制抗菌免疫反應并為細菌定植、增長、傳播創造有利條件[8]，引起急性和持續性感染。

圖1　金葡菌入胞機制Fig 1　The entrance cell mechanism of S.aureus

目前，獸醫臨床上胞內菌感染性疾病的治療主要依賴于抗生素，而抗生素要起到抗菌效果首要前提是在胞內感染靶位達到抑菌濃度，但常規的抗菌藥多難以透過細胞膜屏障進入細胞起到高效的抑菌或殺菌作用。例如，β-內酰胺類因其抗菌譜廣和抗菌活性強是獸藥臨床細菌感染首選藥物之一，但其多數成員與細胞膜的親和力不高，不能有效進入細胞內，且易被胞內溶酶體酶所降解。又如，四環素類透膜能力差，在胞內濃度往往達不到抑菌水平，不僅無法起到有效的治療作用，而且長時間的亞治療劑量還極易誘導細菌耐藥的產生。氨基糖苷類抗生素分子極性強，透膜速率非常緩慢，進入細胞后也主要分布在溶酶體，無法充分的發揮藥理學作用。研究報道，氨基糖苷類特別是慶大霉素對金葡菌的SCVs表型幾乎無效[9]。盡管，氟喹諾酮類抗菌藥物對細胞膜有很強的滲透性且跨膜速率較快，但當胞外的濃度比胞內的濃度低時，可在有機陰離子載體的作用下快速被轉運到胞外，導致其在胞內不能有效蓄積而達不到有效抑菌時間[10]，常造成臨床治療的失敗。大環內酯類抗生素多與生物膜的親和力較高，進入細胞內的速率和效率優于大多數抗菌藥物，常被用來治療胞內勞森菌等畜禽胞內菌感染性疾病，但其在胞內蓄積性能較弱，并且在酸性條件活性較差或變異較大。由此可見，多數常規抗菌藥物不能有效和高效的治療畜禽胞內感染性疾病，從而導致胞內菌感染性疾病嚴重危害了畜牧業的健康發展。

因此，如何利用制劑技術提高抗菌藥物對被感染細胞的傳遞效率、胞內蓄積能力、維持和改善細胞內藥物的活性是解決畜禽胞內感染性疾病治療難題的有效策略。

2　納米抗菌藥物治療胞內感染的有效性和優效性

納米載藥技術是指將藥物溶解、包裹于固體脂質基質、高分子等載體材料中形成納米粒，常用載體有相嵌段共聚物、聚酯類、聚氰基丙烯酸烷酯類、磷脂、長鏈脂肪酸、三酰甘油酯、蜂蠟和膽固醇等。常見的納米載藥系統包括固體脂質納米(SLNs)、脂質體、聚合物納米、樹狀大分子和囊泡等。將藥物制成納米粒后，體內過程依賴于載體的理化特性、粒徑、電位等理化性質，所以藥物經納米載藥系統搭載后與機體有良好的親和性，易于透過機體的生物屏障，在胞內菌的治療中具有優越的發展前景。大量研究表明，上述納米載藥系統可以改善藥物對機體生物膜屏障的透過能力，提高藥物在胞內的蓄積能力，延長藥物的作用時間。研究報道(表1)，利用明膠納米系統和納米乳化技術分別延長了利福平和多西環素、氟苯尼考有效血藥濃度的維持時間[11]和體外釋放時間[12]。Pothayee等制備的聚合物膠束顯著增強了慶大霉素對胞內布魯氏菌的抗菌活性[13]。Zaki等制備的殼聚糖納米粒有效提高了頭孢曲松鈉抗胞內鼠傷寒沙門氏菌的效力[14]。利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米來提高慶大霉素的胞內濃度也有報道[15]。

表1　納米技術提高抗菌藥物性能的研究實例Tab 1　The examples of nanotechnologies improving the effect of antimicrobial

3　納米抗菌藥物在畜禽胞內感染性疾病治療的研究

3.1結核分枝桿菌病的治療眾所周知，結核分枝桿菌感染的治療一直以來在醫學方面都是一項嚴峻的挑戰。結核分枝桿菌導致的結核病是以肉芽腫的發展為特點的慢性傳染病，而且是牛結核病的主要病原菌。2012年結核病被列入貧困國家死亡原因的前十，為這些國家的經濟與醫療保障系統施加了巨大的壓力[16]。結核分枝桿菌不僅具有良好的細胞適應性，且在進化過程中學會了通過抵御宿主環境去平衡宿主的免疫防御策略而生存繁殖[17]。如表2所示，目前研究的用于治療肺結核的納米藥物，其易被內化，優先進入細胞組織與器官，同時具有較高的穩定性與生物利用度，比如PLGA納米可提高抗結核藥物(利福平、吡嗪酰胺、異煙肼)在肺和感染肺泡巨噬細胞中的生物利用度[18]。Gaspar等制備的利福布丁-SLNs延長了利福布丁在THP1細胞內對結核桿菌的抗菌時間[19]。與莫西殺星相比莫西殺星聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)納米粒在巨噬細胞的蓄積能力提高了3倍，蓄積時間延長了6倍[20]。

表2　納米技術提高抗菌藥物治療結核分枝桿菌病的研究實例Tab 2　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of M.tuberculosis

3.2金黃色葡萄球菌感染的治療金黃色葡萄球菌既可以侵入專業吞噬細胞如單核細胞、巨噬細胞、多核性白細胞等細胞內，也可侵入非專業吞噬細胞如內皮細胞與上皮細胞等細胞內[21-22]。侵入細胞后，金葡菌能通過從吞噬體中逃逸、阻止溶酶體和吞噬體結合形成吞噬溶酶體、顛覆細胞自噬等多種特定的生存策略在胞內生存并增殖，最后使被感染細胞裂解，子代從細胞內釋放出來，再次感染其他易感細胞。且金葡菌的突變表型SCVs表型對多種抗生素和環境壓力存在耐性，這也是金葡菌感染難以根治的重要原因之一。納米技術提高抗菌藥物對金葡菌及其耐藥型(MARS)的抗菌效果均有報道(表3)，Rassouli等制備的替米考星納米結構脂質載體(NLC)和脂質核心納米膠囊(LCN)與替米考星比較，對金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)值都降低[23]。也有研究表明利用脂質體技術可以提高達托霉素和克拉霉素對耐甲氧西林金葡菌(MARS)的抗菌活性[24]。Kalhapure等利用固體脂質納米載藥系統延長了鹽酸萬古霉素和克拉唑銀的有效抑菌時間，提高了其對MARS的治療效果[25-26]。

表3　納米技術提高抗菌藥物治療金葡菌感染的研究實例Tab 3　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of S.aureus

3.3沙門氏菌感染的治療沙門氏菌引起的疾病是細菌性人畜共患病之一[27]，其在宿主細胞內具有很強的適應性，主要引起畜禽副傷寒，死亡率很高，給畜牧生產造成了巨大的損失。它可以感染多種類型的細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和上皮細胞[28]，也可進入非吞噬細胞[29]。組織培養實驗發現，鼠傷寒沙門氏菌能夠生存在巨噬細胞內，這表明在宿主細胞內存活是鼠傷寒沙門氏菌致病的一個基本特征[30]。而且在細胞水平上，沙門氏菌在細胞內的定位面臨著獨特的困難[31]，因此，目前有必要采取新的治療措施。據報道，替米考星納米乳、慶大霉素聚合物膠束分別增強了藥物對沙門氏菌抑制作用[32]和在巨噬細胞內的抗菌活性[33]。Xie等制備的恩諾沙星-山萮酸固體脂質納米顯著提高了恩諾沙星在小鼠RAW264.7單核巨噬細胞的蓄積能力，有效延長了抗胞內沙門氏菌的抗菌時間[34](表4)。

表4　納米技術提高抗菌藥物治療沙門氏菌感染的研究實例Tab 4　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of Salmonella

3.4單核細胞增生性李斯特菌感染的治療李斯特菌包括十個菌株，其中，單核細胞增生性李斯特菌是唯一能夠引起人類疾病且一種短小的革蘭氏陽性無芽胞桿菌，被列為20世紀90年代四大食源性疾病致病菌之一，是一種人畜共患病的致病菌，具有潛在的危害性[35-36]。隨著納米藥物的研究不斷深入，如表5所示，有學者研究表明納米鉑顆粒具有優秀的進入單核細胞增生性李斯特菌細胞內的能力[37]。聚氰基丙烯酸異己基酯(PIHCA)納米粒能顯著增強氨芐西林對單核細胞增生性李斯特菌的抗菌活性[38]。Imbuluzqueta等制備的PLGA納米改善了慶大霉素在胞內的積聚能力，從而提高了抗胞內李斯特桿菌的能力[39]。也有報道稱青霉素G脂質體可以有效抑制李斯特菌在胞內的增殖[40]。

表5　納米技術提高抗菌藥物治療李斯特菌感染研究實例Tab 5　The examples of nanotechnologies improving effect of antimicrobial treatment infection of L. monocytogenes

4　納米藥物跨膜和胞內轉運及其影響因素

4.1納米粒跨膜和胞內轉運的研究納米藥物的傳遞是一個極其多樣復雜、動態的過程，涉及方面較多，如內吞作用，細胞內交付，生物降解，藥物釋放和胞外分泌等。因此，綜合全面了解納米藥物入胞機制是發展納米藥物治療胞內菌感染性疾病的前提條件。根據細胞種類不同，納米藥物攝入細胞的途徑主要分為吞噬作用和吞飲兩種，其中巨噬細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞等專業吞噬細胞一般以拉鏈樣和觸發式的吞噬為主，非專業吞噬細胞以巨胞飲、脂伐介導和網格蛋白介導的吞飲為主[41]。

納米藥物進入細胞的途徑不同，其在胞內的轉運方式也不同，大致可分為溶酶體途徑和非溶酶體途徑。據報道，巨胞飲和網格蛋白介導的內吞通常為溶酶體介導的途徑，該途徑中，攜帶藥物的晚期內吞體和溶酶體結合形成吞噬溶酶體，溶酶體將納米材料降解而釋放出藥物；而脂伐介導的內吞常為非溶酶體途徑，納米藥物結合到細胞膜表面后，沿著細胞膜移動到不含有溶酶體的脂伐囊泡中，并最終在胞質中釋放。可見不同納米藥物跨膜和胞內轉運途徑不同，而不同胞內菌入胞侵襲機制和胞內定位也不同，深入研究納米藥物跨膜和胞內轉運途徑，將有助于增加抗菌藥物與胞內菌接觸的機會，提高抗菌的效果。

4.2納米理化性質對其胞內轉運的影響臨床上對于納米藥物的理化性質的研究主要集中在形態結構、粒徑、Zeta電位、材料、表面親疏水性等方面。起初認為粒徑大小與表面電荷是決定細胞攝取和胞內命運的主要因素，隨著研究的深入，發現納米粒正負電荷的種類、材料的強度、表面親疏水性等都可能會影響其與細菌細胞壁的親和力，從而影響其在胞內的轉運。因此，粒徑、電位、表面親疏水性等理化性質是納米藥物的重要特性，它們對于納米藥物治療胞內感染性疾病的效果起著重要的作用。由于細胞膜帶負電荷，通常認為帶正電荷的納米藥物與細胞的親和力更高，但有研究表明帶負電荷的納米藥物與細胞膜親和力也很高，如Straubinger等證明隨著表面負電荷的增加，環丙沙星脂質體和阿奇霉素脂質體的胞內蓄積能力和對結核分枝桿菌的抗菌活性顯著提高[42]。Gasparm等試驗也表明帶有負電荷的納米脂質體更有利于其被細胞攝取[43]。Xie等的研究表明同等粒徑的恩諾沙星-山萮酸固體脂質納米粒，表面電荷的絕對值越大，其細胞攝取率也越高，而電荷的絕對值相近的情況下，納米粒徑越大，越易被細胞攝取[34]。可見納米粒的理化性質與其性能有著重要聯系，對于不同的納米藥物，影響其胞內轉運的決定因素也不一樣，因此，建立能高效胞內傳遞的納米藥物制備理論，將為胞內菌感染的治療提供新模式。

5　納米藥物在胞內感染性疾病治療中面臨的挑戰

綜上所述，納米載藥系統搭載的藥物可經過多種轉運途徑進入細胞，為解決常規抗生素治療胞內菌感染面臨的難題提供了新思路。但是，納米載藥系統要在獸藥領域推廣開來，還面臨著生產成本、系統自身缺陷、安全性等的多重考驗。考慮到藥物分子的理化性質，納米載藥系統有時必須要采用合成高分子載體材料，但達到理想藥效的同時，生產成本和制備技術等問題也給其在獸藥領域的應用提出了挑戰。同時，納米載藥系統還面臨著技術自身缺陷的挑戰。聚合物膠束納米的毒性、有機溶劑的殘留，規模化生產工藝的缺乏等問題制約著其推廣應用。固體脂質納米載藥系統對某些親水性藥物的載藥量過低，脂質狀態的復雜性，儲存過程中的晶型和粒徑的變化是影響其臨床開發的重要瓶頸。脂質體制劑的物理穩定性差、載藥量低、存儲滲漏性和體內的不可控性是其臨床推廣應用亟待突破的關鍵科學和技術難題[44]。安全性是藥物推廣使用的前提，通常認為生理相容的脂質材料是無毒的，但是，有學者提出其納米化后由于粒徑減小和表面能的增加，其毒性可能會發生變化，納米藥物的在體毒性的研究還有待進一步深入。

6　納米抗菌藥物在畜禽胞內感染疾病治療中的發展策略

為解決納米載藥系統面臨的挑戰，減小畜牧生產中因胞內菌感染造成的巨大損失，未來的發展可以從以下幾個發面入手：①現有納米載藥技術的完善和改進，改善現有載藥系統自身面臨的安全性、穩定性、載藥量低等問題，同時加強載體材料修飾的研究，使藥物在體內的過程更符合人類的意愿。②目前理化因素對納米藥物在胞內轉運的影響還尚未有定論，各學者的結論并未統一，進一步深入研究什么范圍內的粒徑、電荷更有利于納米藥物被細胞攝取，這對指導納米載藥系統的制備與優化顯得尤為重要，建立起納米藥物高效胞內靶向傳遞理論，也有利于減小其開發和生產的成本。③利用特定胞內菌的生存策略，開發相應的載藥系統，如圖2所示，Zhang等用紅細胞膜包被抗菌藥物，制備出了紅細胞膜包被的納米凝膠系統，與常規抗菌藥相比該系統顯著提高了抗菌藥對MARS的治療效果，該系統巧妙地利用了金葡菌的生存策略，當金葡菌識別載藥細胞的膜上受體，釋放毒素透化細胞膜進入細胞后，正好暴露在抗生素環境中，整個釋藥系統對金葡菌來說成為了一個陷阱[45]。該技術的提出為解決常規抗菌藥物難以透過細胞膜的難題提供了新思路。④研究表明，成本低廉、安全性好的萜類化合物不僅可以增加藥物的透膜能力[46]，而且可以破壞細菌細胞膜，萜類化合物與抗菌藥物聯合使用來治療胞內菌感染的研究，有待進一步深入。⑤兩親性的樹狀大分子材料因其分子表面較多種類的原子基團，能與多種親水性藥物的原子團共價結合，從而增加藥物與組織細胞的親和力，增加親水性藥物的入胞能力和胞內停留時間[47]，改善藥物的口服生物利用度。大量研究也表明帶有季銨鹽陽離子的樹狀大分子本身也具有抗菌活性，其與抗菌藥物的聯合使用也有利于減緩細菌耐藥性的產生。相信隨著科學技術的不斷發展，研究的不斷深入，納米載藥技術將會更加成熟，更多的納米載藥技術將會運用到解決胞內菌感染的難題上來，為我國畜牧產業的健康發展保駕護航。

圖2　細胞膜包被的納米膠束抗菌機制Fig 2　The mechanism of cell membrane-coated nanoparticles against bacteria

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