小鼠骨髓源性樹突細胞和脾源性樹突細胞的形態及生物學性能對比

張蘭蘭，閆軍堂，劉　敏，胡京紅，于　雪，范盎然，紀雯婷，任　虹，孫震宇

(北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029)

樹突狀細胞(DCs)是機體最重要的抗原提呈細胞，也是唯一能激活初始T細胞的抗原提呈細胞，是機體免疫的始動者，在免疫抑制和免疫耐受等方面發揮著重要作用。近年來人們已經能在體外應用MCM培養基誘導生成高純度的DCs并已應用于腫瘤和過敏性疾病的治療[1]，目前基于DCs的免疫治療也被認為是最具前景的治療方式[2]。一般來說DCs在體內分布較廣，外周血、脾臟、臍帶血、骨髓、皮膚等均有分布[3]，但大都含量極少且獲得困難，如何獲取純度和性能較好的DCs用于更深入的DCs研究已經成為當前實驗研究的重點[4]。近年來學者們對DCs體外培養進行了大量積極的探索，小則從培養手法、因子濃度等入手，大則結合現代生物技術如磁珠分選、流式分選等對其進行研究，DCs培養技術已日漸趨于成熟。相比于其他來源的DCs，骨髓來源的DCs因其培養方法簡單、來源方便、含量較高等特點，成為應用較多的DCs研究來源，但1只小鼠的骨髓前體細胞經常規誘導后僅可生成(1～2)×107個DCs細胞，經分選后僅可獲得前者數量的1/10[5]，遠遠不能滿足當前實驗對DCs的大量需求，故有必要對DCs進行更深入的探索。一直以來，脾源性DCs因其培養周期長、產量低等特點而較少應用于實驗研究[6]，其確切的純度、產量和性能目前尚不明確，基于目前DCs缺乏的現狀，本課題組對脾源性DCs展開了研究。本研究通過在體外獲得骨髓前體細胞和脾細胞，用GM-CSF和IL-4誘導生成DCs，結合流式細胞術(FCM)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)技術從兩者的形態、細胞表面特異性分子表達、相關因子分泌等方面進行對比，以期明確脾源性DCs的性狀和性能，為后期的實驗研究篩選合適的細胞。

1　實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物C57BL/6雌性小鼠，SPF級5周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2012-0001。實驗小鼠均飼養在清潔級環境中統一喂養，取材時遵守人道主義原則，確保小鼠安樂死。

1.1.2主要試劑重組GM-CSF購于R&D(批號：404-ML-010)，重組IL-4因子購于R&D(批號：404-ML-010)，RPMI-1640購自美國Hy-clone公司(批號：11330032)，紅細胞裂解液購于康為世紀，澳洲來源胎牛血清(FBS，批號：10099141)，雙抗(批號：15140122)，PE標記的抗小鼠CD83單克隆抗體(貨號：558205)及其同型對照(貨號：554685)、APC標記的抗小鼠CD11c單克隆抗體(貨號：554686)及其同型對照(貨號：557400)均購于BD公司，LPS購于Sigma公司，IL-12 ELISA試劑盒(批號: LOT20170321002)購于武漢六合生物有限公司。

1.1.3主要儀器INCO2/108型CO2培養箱，Leica-DM2500 型顯微圖像系統，ePPendorf離心機(型號：5810)，Tecan酶標儀(型號：Safire2)，BD流式細胞儀。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓源性DCs的分離與培養處理C57BL/6小鼠脫頸椎處死，無菌條件下分離股骨與脛骨，用無菌紗布將組織剔除干凈后用注射器將骨髓沖至培養皿中，收集到離心管中經離心后加入預溫37 ℃的紅細胞裂解液5 mL，靜置5 min后加RPMI-1640 5 mL終止裂解，離心2次后計數，用完全培養基(含10 ng/mL 重組IL-4、20 ng/mL 重組GM-CSF、10%滅活的FBS及1%雙抗)調整細胞濃度至1×106mL-1，將細胞種于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2溫箱中培養，3 h后棄去上清，加入相同因子濃度的完全培養基繼續培養，48 h和96 h分別進行半換液處理，第8天部分細胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.2小鼠脾源性DCs的分離與培養處理C57BL/6小鼠脫頸椎處死，無菌條件下迅速取脾，研磨于1640培養基中，收集至離心管中經離心后加入預溫37 ℃的紅細胞裂解液5 mL，靜置5 min后加RPMI-1640 5 mL終止裂解，離心2次后計數，用完全培養基(含10 ng/mL 重組IL-4、20 ng/mL 重組GM-CSF、10%滅活的FBS及1%雙抗)調整細胞濃度至1×108mL-1，將細胞種于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2溫箱中培養，3 h后棄去上清，加入相同因子濃度的完全培養基繼續培養，48 h和96 h分別進行半換液處理，第8天部分細胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.3倒置顯微鏡下細胞形態觀察取培養第5，7，8天骨髓源性DCs和脾源性DCs于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4掃面電鏡下細胞形態觀察收集培養第8天骨髓源性DCs和脾源性DCs，用3%戊二醛固定，用70%，90%，100%的乙醇進行梯度洗脫，乙酸異戊脂置換后，CO2臨界點干燥，掃描電鏡觀察細胞表面結構。

1.2.5FCM檢測收集培養第9天細胞，離心后用PBS重懸計數，取100 μL細胞量約為106的細胞于流式管中，分別加入APC標記的CD11c(小鼠DCs特異性表面標記物)抗體及同型對照抗體，PE-CD83及同型對照，室溫避光孵育20 min，離心后流式細胞儀檢測CD11c+及CD11c+CD83+的比例。

1.2.6ELISA檢測收集細胞上清，按照試劑盒說明書檢測IL-12含量。

2　結　　果

2.1倒置顯微鏡下DCs形態培養第5天時，骨髓源性DCs和脾源性DCs均有明顯的毛刺狀突起，懸浮于培養基中，不同的是脾源性DCs開始出現輕微聚集狀態，而骨髓源性DCs大多呈散在狀態，且底壁有明顯的枝狀巨噬細胞，見圖1和圖2。培養第7天時，骨髓源性DCs呈聚集狀態，散在細胞較少，毛刺較之前變大，DCs纏繞在一起，見圖3；脾源性DCs如葡萄狀懸浮于培養基中，其集落大于骨髓源性DCs的集落，見圖4。培養第8天時，骨髓源性DCs聚集狀態變大，呈葡萄狀懸浮于培養基中，細胞周邊可見明顯的毛刺狀突起，見圖5；脾源性DCs成簇狀懸浮于培養基中，其集落較之前明顯變大，而且明顯大于骨髓源性DCs的集落，見圖6。

圖1　培養第5天時骨髓源性DCs形態(×200)

圖2　培養第5天時脾源性DCs形態(×200)

圖3培養第7天時骨髓源性DCs形態(×200)

圖4　培養第7天時脾源性DCs形態(×200)

2.2掃描電鏡下DCs形態培養第8天，骨髓源性DCs表面呈云霧狀，周邊可見明顯的毛刺狀突起，兩個細胞緊緊聚集在一起，見圖7；脾源性DCs表面呈薄紗狀，周邊可見絲狀不定向突起或薄紗狀圓球形突起，5個細胞緊緊纏繞在一起，其集落明顯大于骨髓源性DCs集落，見圖8。

圖5　培養第8天時骨髓源性DCs形態(×200)

圖6　培養第8天時脾源性DCs形態(×200)

圖7　培養第8天時掃面電鏡下骨髓源性DCs形態(×10 000)

圖8　培養第8天時掃面電鏡下脾源性DCs形態(×10 000)

2.3DCs純度收集培養第8天的DCs流式鑒定其純度，先圈出目標細胞，通過同型對照可得骨髓源性DCs純度為(81.567±2.902)%，脾源性DCs 純度為(87.227±4.463)%，脾源性DCs純度高于骨髓源性DCs(t=1.841,P<0.05)。

2.4LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表達情況LPS刺激前，骨髓源性DCs CD11c+CD83+表達比例明顯高于脾源性DCs CD11c+CD83+表達比例(P<0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表達比例均明顯高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs CD11c+CD83+表達比例與骨髓源性DCs比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1及圖9、圖10。

表1　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs CD11c+CD83+表達情況

圖9　骨髓源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表達情況

圖10　脾源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表達情況

2.5LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12情況LPS刺激前，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量比較差異無統計學意義(P>0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量均明顯高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs分泌IL-12量與骨髓源性DCs分泌量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3　討　　論

DCs是Steinman和Cohn于1973年發現的一群外形奇特、具有強大的活化初始T細胞能力的細胞，它是免疫反應的啟動者，具有很強的遷移能力。它起源于機體內的多功能造血干細胞，分為DCs前體細胞、未成熟DCs、成熟DCs 3個成長階段，一般來說未成熟DCs可以通過其TLR直接感知病原體組分(如LPS)而誘導成熟，表現為膜表面共刺激分子上調[7]，分泌因子與趨化因子增加[8]，抗原提呈能力增強[9]，通過JAK/STAT通路使Th1、Th2細胞極化等[10]。研究發現LPS可通過提高iDC表面CD83、CD86的表達，分泌因子能力和刺激T細胞增殖能力的增強等來誘導iDCs的成熟[11]，成熟后的DCs可以更有效地發揮免疫調節作用[12]，但目前DCs尚無特定的表面分子標志及明確的生物學性能，需要結合細胞形態、生物學性能和表面特異性分子3個方面對DCs進行鑒別。

表2　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs分泌IL-12情況

人們已經能在體外用多種因子如GM-CSF、IL-4、IFN-α、Flt3配體、IL-10、IL-6、TPO和IL-13等誘導出純度較高及性能較好的DCs[13],但DCs的產量仍不能滿足當前DCs的實驗需要。面對目前DCs短缺的問題，本課題組對脾源性DCs展開了探索。結果顯示，經LPS誘導DCs成熟后，骨髓和脾臟均可獲得有明顯DCs生物學特性的細胞，純度均為80%以上，且脾源性DCs純度較高，形成的細胞集落也較大。FCM結果顯示LPS刺激前骨髓源性DCs的CD11c+CD83+表達比例明顯高于脾源性DCs 的CD11c+CD83+表達比例，CD83是DCs的表面特異性分子，一般來說低表達于未成熟DCs表面，高表達于成熟DCs表面，LPS是革蘭陰性菌的組成部分，它可以與DCs表面的TLR4結合并通過MyD88依賴性途徑或MyD88非依賴性途徑活化NF-κB分子，繼而介導誘導DCs的成熟[14]，結果說明骨髓源性DCs早于后者成熟，與文獻[15]結果一致；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+的表達均增加，且脾源性DCs 的CD11c+CD83+表達比例與骨髓源性DCs比較差異無統計學意義，提示兩者經LPS刺激后CD11c+CD83+表達情況相似。ELISA結果顯示，骨髓源性DCs和脾源性DCs IL-12分泌量比較差異無統計學意義，提示兩者分泌IL-12的性能相似；經LPS刺激后，兩者分泌IL-12量均明顯升高，可能是經LPS誘導后DCs的轉錄因子IRF-3和NF-κB被激活[16]，繼而分泌更多的IL-12來更好地發揮免疫調節作用，且脾源性DCs 分泌IL-12量與骨髓源性DCs比較差異無統計學意義，兩者DCs生物學特性相似。

實驗過程中發現尚有很多問題有待解決：①在脾源性DCs培養3～5 d時鏡下可見大量的暗色溶出物，筆者推測這部分溶出物可能是在因子選擇下大量的非DCs前體細胞裂解死亡，但未進行深入研究。②關于骨髓前體細胞和脾細胞的種板密度仍需要探討，筆者發現骨髓源性DCs生長后期密度過大，脾源性DCs生長后期密度過小。③由于時間原因,實驗中筆者未對所培養細胞進行MLR(刺激T淋巴細胞增殖實驗)和抗原吞噬能力檢測，關于其特性尚需進一步研究。④脾源性DCs產量僅為骨髓源性DCs的1/7左右，但其純度稍大于骨髓源性DCs，應當在脾源性DCs產量問題上進行深入研究，或許可以采取將脾源性DCs進行體外擴增再繼續誘導培養的方法，但尚不能明確是否可行。

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