清肺益氣方對肺癌干細胞樣細胞增殖的抑制作用及其機制研究

陳　鑫

(河北省廊坊市人民醫院，河北 廊坊 065000)

近年來，肺癌的發病率和病死率呈不斷增高趨勢，且趨向年輕化。研究表明，腫瘤干細胞或腫瘤起始細胞(CICs)存在于多種類型的腫瘤組織中，具備表達胚胎干細胞的部分生物學標志物，并具有強大的增殖和侵襲能力，可使化療藥物發生耐藥[1]。由于肺癌細胞中的CICs可高表達CD44+和CD133+蛋白[2]，同時具備較強的化療藥物耐受性。因此，尋找有效抑制肺癌CICs增殖的藥物成為肺癌研究的熱點。清肺益氣方是我院的協定處方，臨床應用于肺癌患者的治療中，可顯著提高肺癌患者的生存率和生活質量，但其作用機制尚不明確。本研究以肺癌CICs作為研究模型，探討清肺益氣方對肺癌干細胞樣細胞增殖的抑制作用及其可能的作用機制，旨在為清肺益氣方的臨床治療提供理論依據。

1　實驗資料

1.1細胞及主要試劑人肺癌細胞株A549從中國科學院細胞庫選購。清肺益氣方免煎顆粒劑主要由人參、黃芪、黃芩(酒炒)、百合、北梗(炒)、貝母、薏苡仁、升麻、甘草等單味中藥免煎顆粒組成，從深圳三九醫藥股份有限公司選購。四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、核糖核酸酶A(RNase A)均從美國Sigma公司選購。DMEM細胞培養基、胎牛血清(FBS)均從美國Sigma公司選購。兔抗人CD44-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、兔抗人CD133-藻紅蛋白(PE)抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人Caspase-3抗體及兔抗人GAPDH抗體均從美國Sigma公司選購。

1.2實驗動物SPF級健康雄性日本大耳白兔6只，購自河北醫科大學實驗動物中心，體質量1.7～2.5 kg。所有動物在清潔、采光通風良好的動物房中，適應性喂養2 d，自由飲食水，溫度保持在20～26 ℃，環境濕度保持在(56±2)%。

1.3方法

1.3.1含藥血清的制備將6只大耳白兔隨機分為清肺益氣方高劑量組及空白對照組，每組3只。每組早晚灌胃給藥1 次，給藥體積為 10 mL/kg，清肺益氣方高劑量相當于成人臨床生物等效劑量的10倍；空白對照組給予等體積生理鹽水。連續用藥3 d后，于末次給藥后2 h處死白兔，進行心臟取血，1 500 r/min 離心10 min后留取血清，56 ℃30 min滅活后，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存備用。進行指標檢測時，將含藥血清溶于無血清的RPMI-1640 培養液中進行稀釋，確定終濃度后進行后續實驗。

1.3.2肺癌CICs篩選及培養采用含有10%的FBS、100 IU/mL青霉素及100 IU/mL鏈霉素的DMEM培養基對A549細胞進行培養，在37 ℃，5%CO2孵箱中進行傳代培養。當細胞處于穩定生長狀態，即處于對數生長期時進行后續實驗。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA對A549細胞進行預處理，離心后留取細胞沉淀，分別吸取兔抗人CD44-FITC、CD133-PE抗體各2 μL，在4 ℃條件下與細胞沉淀進行孵育，30 min后PBS清洗并重懸細胞，并調整細胞濃度至2×107mL-1。取500 μL調整濃度的細胞懸液在流式細胞儀上對細胞進行分選，采用肺癌CICs表達CD44+/CD133+的細胞進行實驗。

1.3.3肺癌細胞增殖情況檢測采用MTT比色法檢測。將處理后的細胞接種于密度為2×103/孔的96孔細胞培養板中，在37 ℃、5%CO2條件的孵箱中培養至細胞生長呈現指數期時，將濃度為0，5，10，20，40，60，80，100 μmol/mL的清肺益氣方含藥血清加入至培養板中，空白對照組給予1 mL的PBS作為對照，陰性對照組只加細胞和培養液而不做其他干預，均加入20 μL濃度為5 mg/L的MTT，繼續培養4 h后，離心留取上清，DMSO處理后留取沉淀，采用酶標儀檢測對應OD490值，每組設3個復孔，所得的OD取平均值作為最終結果，并參照文獻方法，計算出清肺益氣方對肺癌CICs的IC50濃度。計算細胞生長抑制率(%)=(1-觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.4細胞凋亡情況檢測采用流式細胞術檢測。選擇對數生長期的細胞并將細胞密度調整至1×105mL-1，設置空白對照組、陰性對照組和清肺益氣方組，空白對照組細胞使用1 mL的PBS；陰性對照組只加細胞和培養液；清肺益氣方組給予1 mL IC50濃度的含藥血清處理。于給藥后培養24 h，1 000 r/min離心5 min，棄去上清留取沉淀，PBS清洗后，給予Annexin V-FITC 5 μL，4 ℃條件下進行避光染色，持續約5 min，加入PI 避光染，持續15 min后加入緩沖液，調整至500 μL進行過濾，取過濾后的細胞液進行上樣，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算凋亡率。每份標本共計數10 000個細胞以上，若為死細胞則顯示紅色熒光。

1.3.5肺癌增殖相關基因表達檢測采用實時熒光定量PCR檢測。采用Trizol法抽提1.3.4項中各組細胞的總RNA并通過逆轉錄得到cDNA，采用Primer Premier 5.0及Oligo6軟件完成Caspase-3、p53及18S rRNA的引物設計，以cDNA為模板進行PCR擴增，每個樣本均進行3次的重復實驗，以18S rRNA為內參照。引物序列：Caspase-3上游5’- CTGCCTCTTCCCCCATTCT -3’，下游5’-CGCTTCCATGTATGATCTTTG-3’； p53上游5’- GCTTTCCACGACGGTGAC -3’， p53下游5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’； 18S rRNA上游5’- CGTTGATTAAGTCCCTGCCCTT -3’， 18S rRNA下游5’- TCAAGTTCGACCGTCTTCTCAG -3’。反應條件設置為95 ℃ 預變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算相關基因的相對表達量。

1.3.6肺癌增殖相關蛋白表達檢測采用Western blot法檢測。將處理后的1.3.4項各組細胞收集后抽提總蛋白，采用BCA法進行各組總蛋白濃度的測定，吸取20 μg總蛋白進行上樣，經過預處理變性后，進行SDS-PAGE凝膠電泳后，然后半干電轉化法將蛋白轉移PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入1∶1 000稀釋后的一抗， 4 ℃孵育過夜，TBST液洗滌，加入HRP標記的1∶500稀釋后的二抗，室溫孵育2 h， TBST液洗滌后，ECL化學發光法進行顯色，ChemiDocXRS進行曝光，顯影，得到目的條帶后，Image軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.3.7VEGF和HIF-1α表達檢測收集1.3.4項各組處理完成后細胞培養的上清液，采用ELISA法檢測各組細胞VEGF和HIF-1α的表達水平。

1.3.8肺癌CICs體外侵襲能力檢測各組Transwell小室侵襲實驗法檢測1.3.4項各組變化。

2　結　　果

2.1肺癌CICs體外增殖情況不同濃度清肺益氣方組細胞增殖抑制率均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，且隨著含藥血清濃度的增加其抑制肺癌細胞增殖的作用逐漸增強，即抑制作用呈濃度依賴性，見表1。根據公式計算得到清肺益氣方的IC50為80.12 μmol/mL。以此濃度觀察細胞的形態變化，可見隨著給藥時間的延長，肺癌細胞形態逐漸皺縮變形，壞死脫落。見圖1～5。

表1　清肺益氣方對肺癌CICs體外增殖的抑制作用

注：①與陰性對照組比較，P<0.05。

圖1　空白對照組肺癌細胞形態

圖2　陰性對照組肺癌細胞形態

2.2細胞凋亡情況空白對照組細胞凋亡率為(0.08±0.01)%，陰性對照組細胞凋亡率為(0.02±0.01)%，清肺益氣方組為(17.22±0.55)%，清肺益氣方組細胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。流式細胞儀的散點圖上可見，清肺益氣方組給藥后，體現活細胞的左下象限的活細胞數目逐漸減少，而體現早期和晚期凋亡細胞的右下象限及右上象限凋亡細胞數目增加。見圖6。

圖3　清肺益氣方作用12 h肺癌細胞形態

圖4　清肺益氣方作用24 h肺癌細胞形態

圖5　清肺益氣方作用48 h肺癌細胞形態

2.3肺癌增殖相關基因表達情況清肺益氣方組細胞中Caspase-3和p53 mRNA表達水平均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4肺癌增殖相關蛋白表達情況清肺益氣方組細胞中Caspase-3和p53蛋白表達水平均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3和圖7。

圖6　各組細胞凋亡情況

組別Caspase-3p53陰性對照組1．02±0．09①0．98±0．06①空白對照組0．95±0．06①1．01±0．22①清肺益氣方組3．79±0．645．09±0．77

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

表3　各組肺癌增殖相關蛋白表達灰度值比較

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

圖7　各組肺癌增殖相關蛋白表達情況

2.5肺癌細胞上清液中VEGF和HIF-1α表達情況清肺益氣方組細胞上清液中VEGF和HIF-1α的表達水平均顯著低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4　各組肺癌細胞上清液中VEGF和HIF-1α表達情況

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

2.6肺癌CICs的侵襲抑制情況清肺益氣方組侵襲細胞數為(25.07±15.06)個，陰性對照組為(84.09±15.21)個，空白對照組為(80.33±14.77)個，清肺益氣方組侵襲細胞數顯著低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3　討　　論

近年來，肺癌的發病率和病死率呈逐年增高趨勢，已居于我國城市人口腫瘤發病率的第1位。在眾多確診的肺癌患者中約80%為非小細胞肺癌[3]，約60%是存在遠處轉移的晚期肺癌[4]。大多數患者即使給予積極有效的抗腫瘤治療，5 年生存率仍非常低，大部分患者因腫瘤復發或遠處轉移而死亡。近年傳統中醫藥在肺癌的治療中顯示出了突出的優勢，成為肺癌綜合療法的重要組成部分[5-6]。

傳統中醫學認為，晚期肺癌多屬肺腎虧虛、精血不足、癌毒蘊結之證[7]，故動則氣喘，腰酸膝軟，食欲不振，治當益氣清肺、潤燥止咳[8]。清肺益氣方出自《活人心統》卷下，主治肺痿葉焦，人形憔悴，具有清肺益氣、化痰止咳之效。方中黃芪為主藥，同人參合用，大補元氣，補脾益肺，提高免疫系統功能；黃芩、百合、北梗清肺潤燥、化痰止咳，貝母清肺化痰、散結消腫，薏苡仁補益肺脾之氣、化濕祛痰，升麻升舉陽氣、解毒宣肺，甘草補益肺氣。該方具有控制肺癌進展和復發轉移的作用，可延長患者的生存期，提高機體免疫功能，有效改善患者憋氣、咳嗽、胸痛等癥狀，配合化療藥物可達到減毒增效的目的。本實驗結果顯示，清肺益氣方組的細胞增殖抑制率顯著高于陰性對照組和空白對照組，提示清肺益氣方對肺癌CICs有顯著的細胞毒作用，且隨著含藥血清濃度的增加，其抑制肺癌細胞增殖的作用逐漸增強，呈濃度依賴性，且在80.12 μmol/mL的劑量下隨著給藥時間的延長，肺癌細胞形態逐漸皺縮變形，壞死脫落。而采用Tran-swell小室侵襲實驗檢測結果顯示，清肺益氣方處理組的侵襲細胞數顯著低于陰性對照組和空白對照組，提示清肺益氣方可顯著削弱肺癌CICs在體外基質中的遷移與侵襲能力，抑制腫瘤細胞的增殖與生長。流式細胞術檢測結果顯示，清肺益氣方組細胞凋亡率明顯高于空白對照組及陰性對照組，說明清肺益氣方可有效促進肺癌細胞的凋亡，抑制腫瘤的生長。

Caspase-3是誘導細胞凋亡并抑制其增殖的重要因子，在死亡受體介導的凋亡途徑中發揮關鍵作用，Caspase-3可通過自身切割而被活化，使下游半胱氨酸蛋白酶激活，誘導細胞的凋亡過程[9]。而p53蛋白是作用較為廣泛的腫瘤抑制因子[10]，可通過負向調節細胞生長周期來調節細胞增殖與凋亡。本研究結果顯示，清肺益氣方組細胞中Caspase-3和p53基因和蛋白表達水平顯著高于陰性對照組和空白對照組，說明清肺益氣方可通過上調p53和Caspase蛋白的表達，促進肺癌CICs的凋亡，從而達到抑制肺癌CICs體外增殖的目的。

VEGF是血管內皮細胞生成過程中的最重要的細胞因子，在多種腫瘤的血管生成、腫瘤生長及轉移中發揮重要作用[11-12]。有研究顯示，在肺癌患者中VEGF可呈現高表達，參與了肺癌的病理進程，是反應肺癌惡性程度、淋巴結轉移及預后不良的敏感指標[13-14]。HIF-1α是在缺氧應激反應過程中的重要轉錄因子，當機體組織環境中的氧濃度下降時，其表達可顯著增高，在調控細胞的生長、糖代謝、氧的轉運和利用等多個方面發揮重要作用[15-16]。其可上調VEGF的mRNA和蛋白水平。有研究證實，當腫瘤發生轉移時，HIF-1α可上調VEGF的表達，從而促進腫瘤血管的生成，促進腫瘤細胞的增殖[15，17]。本研究結果顯示，清肺益氣方組細胞上清液中VEGF和HIF-1α的表達水平顯著低于陰性對照組和空白對照組，說明清肺益氣方可能通過抑制VEGF和HIF-1α的表達，從而抑制腫瘤血管生成，達到抗腫瘤作用的目的。

綜上所述，清肺益氣方對肺癌CICs具有顯著的抑制作用，其機制可能通過上調凋亡抑制基因和蛋白p53和Caspase-3的表達，促進肺癌CICs的凋亡，削弱肺癌CICs的遷移與侵襲能力，并抑制VEGF和HIF-1α的表達，抑制腫瘤血管的生成等多個靶點發揮抗腫瘤增殖的作用。

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