結直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞分布特征及意義

王興芬,張向蓮，許麗萍，鄭海燕，孫保存

(天津醫科大學第二醫院，天津300211)

結直腸癌是我國常見腫瘤之一，復發和轉移是患者死亡的主要原因，但目前尚無任何臨床病理特征或分子標志物可預測哪些患者可能會發生轉移。腫瘤干細胞是一群具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，是腫瘤復發、轉移的根本原因。我們通過免疫雙染法檢測結直腸癌浸潤性成分(浸潤性前沿、淋巴結轉移灶、癌結節、肝轉移灶)中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞的分布特征，并探討其意義。現報告如下。

1　 資料與方法

1.1臨床資料從天津醫科大學第二醫院病理科2011～2014年結直腸癌手術切除標本中選取64例結直腸癌(其中高中分化34例，低分化30例；伴淋巴結轉移者37例，無淋巴結轉移者27例；伴軟組織癌結節者23例，不伴軟組織癌結節者41例)，20例結直腸腺瘤，18例結直腸癌肝轉移灶(選自本組結直腸癌標本中手術切除肝轉移灶)和10例陰性切端(均為本組結直腸癌距離癌灶5 cm以上陰性切緣)作為研究對象，結直腸癌標本中男28例、女36例，年齡41～85歲，中位年齡70歲。

1.2芯片制作標本術前均未行放化療，每例標本均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，經兩名從事多年病理診斷工作的醫師對切片進行復閱，根據張登才等[1]發明的簡便組織芯片制作方法制作芯片，首先用穿刺針在空白蠟塊打孔作為受體蠟塊，然后觀察患者石蠟標本(供體)蠟塊HE切片，鏡下標記正常結直腸腸黏膜、腺瘤，結直腸癌灶中心、浸潤性前緣、淋巴結轉移灶、癌結節、肝轉移灶為結直腸癌浸潤性成分。骨髓穿刺針抽取供體蠟塊相應組織柱，將穿刺的組織柱推入受體蠟塊孔內，制備5×7陣列石蠟組織芯片，將蠟塊放入60～70 ℃烤箱中，約3 min取出，輕輕擠壓蠟塊使穿刺的組織柱與受體蠟塊相融，自然冷卻后作為制作完成的組織芯片。

1.3結直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞分布特征觀察采用免疫組化雙重染色法。CD44兔抗人多克隆抗體、ki-67鼠抗人單克隆抗體及免疫組化雙染試劑盒均購自北京中杉金橋試劑公司，實驗方法參照免疫組織化學雙重染色說明書進行。結果判定：CD44蛋白定位于腫瘤細胞膜，酒紅顯色，呈紅色；ki-67蛋白定位于腫瘤細胞核，DAB顯色，呈棕黃色-棕褐色。判讀方法：以芯片上每個點為單位，計數CD44+/ki-67-細胞數所占的百分比，無表達為-，≤5%為+，6%～15%為++，>15%為+++。

1.4統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。通過χ2檢驗比較CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞與結直腸癌患者臨床病理特征間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞在正常結直腸黏膜、結直腸腺瘤、結直腸癌及其浸潤性成分中的分布CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞胞膜呈紅色，細胞核呈藍色，在正常結直腸黏膜組織中無表達；在結直腸腺瘤組織中散在單個或灶性表達，+者3例；在結直腸癌組織中，-者3例，+者16例，++者22例，+++者23例，CD44+/ki-67-細胞較正常結直腸黏膜和結直腸腺瘤分布數量增多(P均<0.05)，主要位于癌灶基底部，單個或灶性分布，浸潤性成分(浸潤性前緣、淋巴結轉移灶、癌結節及肝轉移灶)及脈管癌栓中呈簇或小片狀分布，形態主要為胞核大，呈卵圓形，胞質較少，但各浸潤性成分之間CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞的分布差異無統計學意義，但均較癌灶中心分布數量多(P<0.05，表1)。

表1　結直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞的分布特征

表2　CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞分布與結直腸癌患者臨床病理特征的關系(例)

2.2CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞與結直腸癌患者臨床病理特征的關系癌組織中不同性別和年齡者CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞的數量差異無統計學意義，但與組織分化程度、是否伴有淋巴結轉移和癌結節均有關(P均<0.05，表2)，高中分化者低于低分化者，伴淋巴結轉移和癌結節者較不伴淋巴結轉移和癌結節者分布數量多(P<0.05，表2)。

3　討論

在我國，結直腸癌總的發病率在所有惡性腫瘤中位居第四位，而在城市，其發病率位居第二位，并呈逐年上升趨勢[2]。目前結直腸癌的主要治療手段仍以手術為主，輔助放化療及中醫治療，但治療效果并不理想。患者的生存率取決于腫瘤被發現時所處的臨床分期，Ⅰ期結直腸癌5年總生存率為85%～90%，但Ⅳ期結直腸癌總生存率則<5%[3]。在結直腸癌治療過程中的主要難題不是去除腫瘤原發灶，而是轉移灶的形成，即浸潤和轉移是結直腸癌患者死亡的主要原因。

腫瘤干細胞學理論于2001年由Reya等[4]提出,之后研究者從各種腫瘤組織中陸續發現了腫瘤干細胞，證明腫瘤干細胞是引發腫瘤生長分化的決定性細胞[5]，其具有強致癌性，因此治療腫瘤的關鍵在于有效清除腫瘤干細胞[6]，目前流行的靶向治療就是方法之一，但靶向治療的前提條件是找到并標記腫瘤干細胞。目前已發現眾多腫瘤干細胞標記物，在結直腸癌中CD133、CD166、CD44、CD24、ALDH1、EpCAM、Oct4等是可能的腫瘤干細胞標記物[7]。通常研究者會聯合應用兩種或三種標記物對腫瘤干細胞進行標記，但迄今為止沒有哪種標記物能真正代表腫瘤干細胞，CD44是目前被承認最多的標記物，研究發現，將100個CD44+結腸癌細胞種植裸鼠體內可形成癌灶，培養單個CD44+結腸癌細胞就能形成細胞集落，RNA干擾法降低CD44表達后，細胞集落生長緩慢并顯著減少，證明CD44+結腸癌細胞具有干細胞的特性[8]。腫瘤干細胞與正常干細胞相似，均處于細胞靜止期(G1/G0期)，即具有低增殖的特性[9]，二者主要區別在于正常干細胞是受調控的自我更新分化，而腫瘤干細胞是失控的生長[10]。顏暢等[11]結果顯示，ki-67-/low細胞為慢增殖細胞，具有顯著的自我更新能力，根據腫瘤干細胞的特性及定義，ki-67-/low可在結直腸癌中作為富集腫瘤干細胞的標記物。本研究結果顯示，CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞在結直腸正常黏膜中無分布，在腺瘤中少量分布，在癌組織中的分布數量明顯增多，且在伴有淋巴結轉移和癌結節的腫瘤組織中，其分布數量均增多，差異有統計學意義，說明CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞在結直腸癌惡性生物學行為中起重要作用。

盡管惡性腫瘤的檢測和治療手段取得較大進步，但遠處轉移，尤其是肝轉移仍是結直腸癌患者死亡的主要原因[12]。浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞呈優勢分布，較癌灶中心明顯增多。脈管癌栓中，腫瘤細胞團以CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞為主，CD44+/ki-67-腫瘤干樣細胞在結直腸癌惡性生物學行為中起重要作用。

參考文獻：

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[12] 姚宏偉,張忠濤.結直腸癌肝轉移的規范化診斷和治療[J].中華胃腸外科雜志,2017,20(7):753-757.