黃芪總黃酮對K562細胞凋亡及細胞周期的影響

張冬青，汪德清，李 卉，吳亮亮

(解放軍總醫院1.輸血科，2.腫瘤科，北京 100853)

白血病是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，兒童尤其多見。黃芪總黃酮(total flavonoids of Astragalus，TFA)是從蒙古黃芪中分離的抗氧化、清除自由基的主要活性成分［1，2］，系列研究表明TFA具有抗損傷、抗突變、抗腫瘤和抑制動脈粥樣硬化等多種生物學效應［3～5］。本研究以人紅白血病細胞株(K562)作為研究對象，采用MTT法檢測了不同濃度TFA對K562細胞株的生長抑制作用，并研究其對K562細胞周期的作用，通過體外實驗研究TFA的抗腫瘤活性，為黃芪提取物抗腫瘤實驗的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 黃芪總黃酮(TFA)，解放軍總醫院生化科分離鑒定，高壓消毒，以適量DMSO溶解后，加培養基稀釋至所需濃度，四噻唑藍(MTT)、AnnexinV-FITC和細胞周期試劑盒(凱基生物科技發展有限公司);10%新生牛血清的RPMI 1640培養基(Gibco)。

1.2 MTT法檢測TFA對K562細胞增殖的抑制作用

K562細胞按1×104個細胞/孔/100 μl接種于96孔板，加入10 μl不同濃度的TFA/同體積培養液，使終濃度分別為20、50、100和200 mg·L－1，每個濃度設 6個重復孔，并設溶劑對照孔，置37℃、5%CO2孵箱培養24 h后每孔加入MTT 20 μl，繼續置37℃、5%CO2孵箱培養4 h，然后吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μl終止反應，混勻后于波長492 nm測定光密度值(OD)，然后計算癌細胞生長抑制率，計算公式:腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1－給藥組A450/細胞對照組A450)×100%，半數抑制濃度(IC50)計算方法:用細胞存活率對劑量對數作圖并按作圖法求出IC50值。

1.3 Annexin V-FITC雙染法檢測TFA誘導K562細胞凋亡的作用 取對數生長期的K562細胞，以1×107·L－1個細胞的密度接種于25 ml培養瓶中，收集培養2、4、6、12和24 h的未加藥組和加TFA組(100 mg·L－1)，標記Annexin V和PI后，上流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡比例。

1.4 細胞周期測定 25 cm2的培養瓶每瓶接種5×106細胞，加入TFA，藥物濃度為其IC50，培養24 h后，用PBS洗滌細胞兩次，2 000 r·min－1離心5 min，然后用 PBS完全吹懸細胞，用體積分數70%的乙醇固定，4℃固定48 h以上;染色前用 PBS洗去乙醇，2 000 r·min－1離心 5min，洗兩遍，加100 μl RNase A 37℃水浴 30 min，再加入 400 μl PI染色混勻，4℃避光30 min，上流式細胞儀進行檢測，分析細胞周期變化。根據公式計算細胞增殖指數〔PI%=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)〕。

2 結果

2.1 TFA對K562細胞增殖的抑制作用 TFA作用于K562細胞24、48和72 h后，在一定濃度范圍內(20～200 mg·L－1)，隨著藥物濃度增加，細胞的抑制率與TFA濃度大小呈正相關，即樣本濃度越高，對腫瘤細胞的抑制率越高，且在24、48和72 h的半數抑制濃度(IC50)分別為98.63、87.90和 63.10 mg·L－1。

2.2 TFA對K562細胞凋亡的影響 在流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限顯示早期凋亡細胞，右上象限是晚期凋亡及壞死細胞。TFA以100 mg·L－1處理K562細胞后，其凋亡率無明顯變化(Tab 1)。

Tab 1The apoptotic effect of TFA on K562 cells(±s)

Tab 1The apoptotic effect of TFA on K562 cells(±s)

Treated hour Apoptotic plus necrotic cells/%Early apoptotic cells/%2 5.3±1.28 2.6±0.52 4 9.8±2.43 4.1±0.89 6 11.4±3.23 6.9±1.63 12 14.3±3.07 7.2±1.08 24 12.5±2.98 7.8±1.21

2.3 TFA對K562細胞周期的作用 K562細胞給藥24 h，PI染色后使用流式細胞儀進行檢測分析。經TFA(50，100 mg·L－1)處理24 h后，G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少。

3 討論

白血病K562細胞株是一個來源于人類慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)病人急變的紅白血病細胞株。迄今化療仍是白血病最重要和最基本的治療手段，祖國傳統醫學對治療白血病具有很強的臨床優勢，很多中藥制劑都有明顯療效。黃芪是一味歷史悠久、臨床應用十分廣泛的中藥，具有免疫調節、抗病毒、抗氧化和抗突變等作用，并且能抑制小鼠腫瘤生長，許杜鵑等［6］發現黃芪總苷對小鼠移植性肝癌(HepA)和S180肉瘤的生長均有明顯抑制作用，在體外亦可明顯抑制HeLa細胞的生長。蒙古黃芪干燥根中分離純化出的凝集素，發現其對K562細胞的增殖有抑制作用［7］。

實驗研究表明黃芪總黃酮是黃芪中分離的抗氧化清除自由基的主要活性成分，能明顯抑制紅白血病細胞系K562細胞的生長，作用24 h后，顯微鏡下可見細胞明顯減少，在實驗所取劑量范圍之內，隨著TFA濃度的增大及作用時間的延長，其抑制效果明顯增強，呈濃度和時間依賴關系。黃芪總黃酮對K562細胞作用24 h后，無明顯的誘導凋亡的作用，但是黃芪總黃酮可以將K562細胞阻滯于G0/G1期。表明使細胞停滯于G1期，同時在TFA的作用下，S期的K562細胞明顯減少，說明其增殖活性已有所減弱。因此，有必要對黃芪總黃酮的作用機制做深入的研究，以闡明藥物在腫瘤細胞凋亡、分化、增殖抑制中的作用，探求其用于白血病治療的可能性。

［1］汪德清，沈文梅，田亞平，等.黃芪的三種提取成分對氧自由基的作用［J］.中國藥理學通報，1994，10(2):129－32.

［1］Wang D Q，Shen W M，Tian Y P.The effects of the three components isolated from astragalus mongholicus bunge on scavenging free radical［J］.Chin Pharmacol Bull，1994，10(2):129－ 32.

［2］汪德清，沈文梅，田亞平，等.黃芪有效成分對氧自由基清除作用的ESR研究［J］.生物化學與生物物理進展，1996，23(3):260－2.

［2］Wang D Q，Shen W M，Tian Y P.Scavenging effects of active principles from astragalus mongholicus bunge on oxygen free radicals studied by ESR［J］.Prog Biochem Biophys，1996，23(3):260－2.

［3］汪德清，田亞平，宋淑珍，等.黃芪總黃酮抗突變作用實驗研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(12):1164－7.

［3］Wang D Q，Tian Y P，Song S Z.Anti-mutagenesis effects of total flavonoids of Astragalus［J］.China J Chin Mat Med，2003，28(12):1164－7.

［4］汪德清，李 煜，田亞平，等.黃芪總黃酮對BEL27402細胞的體外抑制作用［J］.軍醫進修學院學報，2005，26(5):331－3.

［4］Wang D Q，Li Y，Tian Y P.Inhibition effects of total flavonoids of a stragalus on BEL27402 cellin vitro［J］.Acad J PLA Postgr Med Sch，2005，26(5):331－3.

［5］汪德清，丁保國，Tomas Neil，等.黃芪總黃酮對動脈粥樣硬化早期形成的影響［J］.中國藥理學通報，2003，19(6):637－40.

［5］Wang D Q，Ding B G，Neil T.Effects of total flavonoids of astragalus on early atherosclerosis in rabbits with diet-induced hypercholesterolemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(6):637－40.

［6］許杜娟，吳 強，楊 雁，等.黃芪總苷的抑瘤作用及其作用機制［J］.中國藥理學通報，2003，19(7):823－6.

［6］Xu D J，Wu Q，Yang Y.Antitumor activity of AST and its mechanism of action［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(7):823－6.

［7］李艷霞，閆巧娟，孫 艷，等.蒙古黃芪凝集素對K562細胞的增殖抑制和誘導凋亡［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):904－7.

［7］Li Y X，Yan Q J，Sun Y，et al.Antiproliferation and apoptosis of K562 cells by Astragalus Mongholicus Lectin［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):904－7.