小檗堿對胰島素抵抗模型小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α/骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4表達的影響

萬仕煒, 郁　梅, 張　珂, 韓詩雨, 尚宜志, 方彭華, 張真穩

(1. 江蘇省泰州市南京中醫藥大學翰林學院 基礎醫學實驗中心, 江蘇 泰州, 225300; 2. 江蘇省蘇北人民醫院 內分泌與代謝科, 江蘇 揚州, 225001; 3. 南京中醫藥大學附屬泰州市中醫院, 江蘇 泰州, 225300)

2型糖尿病發病機制是多種因素綜合導致的后果，以胰島素受體或受體后缺陷引起的胰島素抵抗為主要病理特征。胰島素抵抗能夠導致骨骼肌、脂肪等組織攝取與利用葡萄糖減少，引起高血糖。骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)表達減少是產生胰島素抵抗的重要原因[1]。探尋能夠促進骨骼肌GLUT4表達的方法已成為降低機體胰島素抵抗的重要研究方向。

江蘇省六大人才高峰課題(WSN-113); 江蘇省泰州市科技支撐(社會發展)項目(TS201723)

小檗堿主要從中藥黃連提煉出來的一種異喹啉生物堿，其作用非常廣泛[2]。在體和離體研究結果[3-4]表明，小檗堿具有改善胰島素抵抗、降低血糖、糾正脂質紊亂的作用，然而其確切機制尚不清楚。為進一步探討小檗堿改善胰島素抵抗的機制，本實驗通過胰島素抵抗模型小鼠探索其對骨骼肌細胞GLUT4蛋白表達的影響及其機制，現報告如下。

1　材料與方法

1.1　藥物和試劑

小檗堿(Berberine)購于Sigma公司。Trizol、cDNA逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.2　動物模型

揚州大學比較醫學實驗中心購買60只3周齡健康C57/BL6雄性小鼠。小鼠依據體質量隨機分配在裝有木屑的聚丙烯鼠籠中，飼養條件: 溫度(21±2)℃，相對濕度(50±15)%, 12 h晝夜循環，自由進食(高脂飲食或標準飼料)。標準飼料由60%碳水化合物，21%蛋白質和19%脂肪所組成。高脂飲食組成包括約20%碳水化合物，21%蛋白質和59%脂肪。喂養8周后，用快速血糖儀測定所有小鼠空腹血糖。繼續喂食2周，每周測量1次血糖，連續2次測量血糖水平都超過7.8 mmol/L的小鼠即為胰島素抵抗模型小鼠。然后分為3組: 小檗堿用藥組(n=8)每日灌胃小檗堿50 mg/kg, 肥胖對照組(n=8)和正常對照組(n=8)每日灌胃生理鹽水，連續給藥2周。給藥結束，測小鼠12 h空腹血糖并進行糖耐量試驗，收集血液和骨骼肌組織標本。血液用3 500 轉/min離心10 min來提取血漿。所有標本置于-80℃冷凍待測。

1.3　胰島素敏感性檢測

測完空腹血糖12 h后腹腔注射葡萄糖(1.5 g/kg溶于無菌水中, 10 mL/kg), 然后分別在0、15、30、60、90和120 min的時候檢測小鼠尾靜脈中血糖水平。

1.4　胰島素檢測

通過ELISA法檢測血漿胰島素。根據說明書, 3次重復檢測，并且選取測量的平均值。

1.5　Real-time PCR檢測GLUT4和PGC-1α

1 mg骨骼肌Trizol提取總RNA。采用分光光度法在260/280 nm波長下計算RNA濃度，而RNA的完整性是通過運行樣本在TAE緩沖液(40 mmol/L三乙酸，1 mmol/L EDTA)中的1%瓊脂糖凝膠的狀況來觀察。之后將1 μg RNA逆轉錄為20 μL cDNA, 通過實時定量PCR熒光檢測測定GLUT4 mRNA和PGC-1α表達水平。以下是寡核苷酸引物: GLUT4 forward 5′-ACAGGGCAAGGATGGTAGA-3′, reverse 5′-TGGAGGGGAACAAGAAAGT-3; PGC-1α Forward 5′-ACCATGACTACTGTCAGTCACTC-3′, Reverse 5′-GTCACAGGAGGCATCTTTGAAG-3′; GAPDH Forward 5′- AGAACATCATCCCTGCATCC -3′, Reverse 5′- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3′。總反應體系20 μL, 擴增條件: 95 ℃10 min下開始最初變性; 95 ℃15 s, 62 ℃ 60 s, 循環40次。反應結束后收集分析擴增曲線及溶解曲線，采用2-ΔCt×100%對Real-time PCR的結果進行相對定量統計。

1.6　數據分析

通過單因素方差分析對多組間平均值進行比較，并取得平均值±標準差。以P<0.05為差異有統計學意義。采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。

2　結　果

2.1　小鼠血糖及胰島素變化

從圖1可以看出，與正常對照組相比，肥胖對照組小鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01), 胰島素水平顯著升高(P<0.05)。與肥胖對照組相比，小檗堿組小鼠空腹血糖水平顯著降低(P<0.01), 胰島素水平略升高(P>0.05)。

2.2　小鼠葡萄糖耐量試驗(IGTT)和AUC指數

從圖2可以看出，與正常對照組相比，肥胖對照組小鼠0、15、30、60、90、120 min血糖水平均顯著升高(P<0.01), AUC胰島素抵抗指數顯著增加(P<0.01)。與肥胖對照組相比，小檗堿組小鼠0、15、30、60、90、120 min血糖水平均顯著降低(P<0.01), AUC胰島素抵抗指數顯著降低(P<0.05)。

**P<0.01 vs. OC; #P<0.05 vs. NC; ##P<0.01 vs. NC.

**P<0.01 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

圖2各組小鼠IGTT和AUC變化水平

2.3　小鼠骨骼肌細胞GLUT4mRNA和

PGC-1αmRNA表達水平

從圖3可以看出，與正常對照組相比，肥胖對照組小鼠GLUT4mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。與肥胖對照組相比，小檗堿組小鼠GLUT4mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)。

從圖4可以看出，與正常對照組相比，肥胖對照組小鼠PGC-1α mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。與肥胖對照組相比，小檗堿組小鼠PGC-1α mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)。

**P<0.01 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

*P<0.05 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

圖4各組小鼠骨骼肌PGC-1α基因表達水平

3　討　論

2型糖尿病是常見的慢性非傳染性疾病。目前，中國糖尿病患者人數和增長率均居世界第一，其中95%以上都是2型糖尿病。2型糖尿病發病機制復雜，主要由于胰島素抵抗引起[5]。近年來越來越多的研究[6-8]表明小檗堿對2型糖尿病動物模型具有改善胰島素抵抗、降低血糖、糾正脂質紊亂的作用。本研究顯示，與肥胖對照組相比，小檗堿灌胃后小鼠血糖顯著下降，表明小檗堿能夠降低胰島素抵抗小鼠的血糖效應，然而小檗堿灌胃后小鼠胰島素水平略升高，表明小檗堿對糖尿病小鼠的胰島素分泌無顯著性的影響。與肥胖對照組相比，小檗堿灌胃后小鼠葡萄糖清除能力明顯升高，胰島素抵抗指數明顯下降，表明小檗堿能夠增加胰島素敏感性，降低胰島素抵抗。

GLUT4的表達減少是導致胰島素抵抗的重要因素之一[1, 9]。骨骼肌細胞膜上GLUT4的數量和活性，決定了機體對葡萄糖的攝取和胰島素敏感性。本研究顯示，肥對照組小鼠骨骼肌細胞GLUT4 mRNA水平明顯低于健康對照組小鼠。與糖尿病對照組相比，小檗堿灌胃后小鼠骨骼肌細胞GLUT4 mRNA水平顯著升高，表明小檗堿能夠促進胰島素抵抗小鼠的骨骼肌細胞GLUT4 mRNA表達水平，提高胰島素敏感性。

PGC-1α能夠提高外周組織對糖、脂氧化代謝，改善胰島素抵抗。大鼠骨骼肌PGC-1α過表達能夠增加骨骼肌細胞GLUT4表達水平，逆轉2型糖尿病或肥胖[10]。本研究發現，小檗堿能夠顯著增加骨骼肌PGC-1α表達。PGC-1α可能是介導小檗堿提高GLUT4表達，增加胰島素敏感性重要機制之一。

[1] Leto D, Saltiel A R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4[J]. Nature Reviews Molecular Cell biology, 2012, 13(6): 383-396.

[2] Cicero A F G, Tartagni E. Antidiabetic properties of berberine: from cellular pharmacology to clinical effects[J]. Hospital Practice, 2012, 40(2): 56-63.

[3] Shan CY, Yang JH, Kong Y, et al. Alteration of the intestinal barrier and GLP2 secretion in Berberine-treated type 2 diabetic rats[J]. J Endocrinol, 2013, 218(3): 255-262.

[4] Gu JJ, Gao FY, Zhao TY. A preliminary investigation of the mechanisms underlying the effect of berberine in preventing high-fat diet-induced insulin resistance in rats[J]. J Physiol Pharmacol, 2012, 63(5): 505-513.

[5] IDF Diabetes Atlas. Global estimates of diabetes prevalence for 2015 and projections for 2040[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2015, 98: 524-525.

[6] Yang J, Yin J, Gao H, Xu L, Wang Y, Xu L, Li M. Berberine improves insulin sensitivity by inhibiting fat store and adjusting adipokines profile in human preadipocytes and metabolic syndrome patients[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2012, 2012: 363845-363853.

[7] 陳 廣, 陸付耳, 王增四, 等. 小檗堿改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗與PI3K、GLUT4蛋白相關性的研究[J]. 中國藥理學通報, 2008, 24(8): 1007-1013.

[8] Choi BH, Ahn IS, Kim YH, et al. Berberine reduces the expression of adipogenic enzymes and inflammatory molecules of 3T3-L1 adipocyte[J]. Exp Mol Med, 2006, 38(6): 599-605.

[9] Bose A, Guilherme A, Robida S I, et al. Glucose transporter recycling in response to insulin is facilitated by myosin Myo1c[J]. Nature, 2002, 420(6917): 821-824.

[10]Bostrm P, Wu J, Jedrychowski MP, et al. A PGC-1α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis[J]. Nature, 2012, 481: 463-468.