響應面法優化檳榔核多酚提取工藝

成煥，王傳花，2，李珂，2，郭亦晨，趙志友，王遠亮，2，*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.湖南省檳榔加工與食用安全工程技術研究中心，湖南湘潭411201；4.湖南省檳榔產業技術創新戰略聯盟理事長單位，湖南湘潭411201）

檳榔為棕櫚科植物檳榔（Areca catechu L.）的成熟種子。原生長在馬來西亞的熱帶雨林中，目前主要分布在印度和東南亞各國[1]。外形呈扁球形或圓錐形，表面淡黃棕色或淡紅棕色，質地堅硬，斷面可見大理石樣花紋。檳榔含生物堿、鞣質、脂肪油及檳榔紅色素、氨基酸等成分，具有殺蟲，消積，行氣，利水，截瘧的功效[2]。檳榔作為世界四大嗜好品之一，大部分以果殼加工制品進行銷售[3]，果核部分多作為廢品處理。近來研究表明[4-5]，檳榔果核中含有大量多酚，值得進行理化研究和深加工處理。目前已從檳榔中檢測出的酚類物質主要有兒茶素、單寧酸、表沒食子兒茶素、表兒茶素等9種物質[6-8]，這些化合物具有良好的抗氧化活性[9-10]，在治療炎癥[11-12]、心血管疾病[13]、癌癥[14]等方面具有藥用潛力。

近年來，隨著人們對食品安全性的重視，天然產物的開發利用得到了極大發展，植物多酚以其分布的廣泛性、生理功能的多樣性以及來源豐富性等特點[15]，成為了當前研究的熱點。將這些生物活性多酚與檳榔中的有害成分分離，既可促進對檳榔的安全使用又有益環境。該試驗以檳榔鮮果為原料，采用響應曲面設計方法，以提取劑濃度、提取溫度、提取時間、料液比為試驗因素，以提取液中的多酚含量為評價指標，分別進行二次多項回歸方程擬合及其優化分析，有效的提高多酚得率，為后續研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

檳榔鮮果：2017年1月購于海南省定安縣，果核干燥、粉碎備用。

無水乙醇：鄭州派尼化學試劑廠；甲醇：國藥集團化學試劑有限公司；丙酮：衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；無水碳酸鈉：上海虹光化工廠；Folin酚試劑：合肥博美生物；沒食子酸一水物（純度≥98.5%）：上海瑞永生物科技有限公司。

1.2　儀器與設備

ANJIEFD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5A臺式多管架離心機：長沙英泰儀器有限責任公司；WFJ7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52系列旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；CP411電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3　方法

1.3.1　沒食子酸工作曲線的繪制

以沒食子酸為標準品，參考GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[16]，根據FC-酚法制作標準曲線。稱?。?.110±0.001）g沒食子酸（相對分子質量188.14），制成100 mL標準溶液。分別移取1.0 mL～7.0 mL到100 mL容量瓶并定容，再各移取1.0 mL與5.0 mL 10%的Folin酚試劑和4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液于室溫暗反應1 h，在765 nm波長條件下測吸光值。以沒食子酸標準溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標，溶液吸光度為縱坐標，得到標準曲線為：Y=0.011 X+0.017 7（R2=0.999）。

1.3.2　檳榔干物質測定

取檳榔鮮果，分別采用熱風干燥和冷凍干燥后充分粉碎，收集果核粉末，用恒重法[17]進行測定。

干物質質量按下式計算：

式中：m0為試樣原始質量，g；m1為干燥后試樣質量，g。

1.3.3　檳榔核多酚的提取及其含量測定[16]

準確稱取果核粉末0.2 g，加入10 mL提取劑，采用水浴加熱法進行提取，冷卻后于3 500 r/min離心10 min，收集上清液，加提取劑定容至10 mL為母液，取母液1.0 mL用水定容至100 mL為測試液。取測試液1.0 mL，采用和標準曲線相同的方法測定樣品中總多酚的含量，以沒食子酸計。

多酚得率按下式計算：

式中：A為樣品測試液吸光值；V為樣品提取液體積，mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，稀釋因子為100）；SLOPstd為沒食子酸標準曲線的斜率；m為樣品干物質質量，%；m1為樣品質量，g。

多酚含量按下式計算：

式中：C為溶液中多酚質量濃度，mg/mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，稀釋因子為100）；V為樣品提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.4　單因素試驗[18-19]

按1.3.3中操作方法對檳榔核中的多酚進行提取和測定，固定其他條件不變，分別考察干燥方式（熱風干燥60℃處理24 h、冷凍干燥-53℃處理24 h）；提取劑（水、70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮）；提取劑體積分數（30%～70%）；提取溫度（40℃～80℃）；提取時間（10 min～90 min）；料液比 1 ∶20（g/mL）～1 ∶60（g/mL）；提取次數（1次～5次）對多酚提取率的影響，以提取液中的多酚含量為考察指標。

1.3.5　響應面試驗設計[20]

根據單因素試驗的結果進行顯著性分析，選取對多酚提取率影響較大的4個因素進行試驗設計，利用Design-Expert 8.0軟件進行數據擬合，以多酚含量為響應值，確定檳榔核多酚最適宜提取條件，并進行驗證，響應面設計因素水平及編碼見表1。

表1　響應面設計因素水平及編碼Table 1　Factors and their coded levels used in experimental design for response surface methodology

1.4　統計分析

每個單因素試驗平行處理3次，采用SPSS 21.0軟件處理數據、顯著性分析、制作圖表，結果用x±s表示；響應面結果用Design-Expert 8.0軟件進行參數優化及方差分析。

2　結果與分析

2.1　檳榔核干物質質量

按1.3.2方法操作，測得烘干和凍干的檳榔核干物質質量分別為92.96%和89.89%。

2.2　單因素試驗結果

2.2.1　不同干燥方式與提取劑對檳榔核多酚得率的影響

不同干燥方式與提取劑對檳榔核多酚得率的影響見圖1。

圖1　不同干燥方式與提取劑對多酚得率的影響Fig.1　Effect of different drying methods and extractants on the extraction efficiency of polyphenols

有圖1可以看出，長時間的熱風干燥會使多酚大量損失。C Ratti在試驗中指出，熱風干燥會引起材料皺縮，成分損壞，而冷凍干燥的過程中樣品的結構不會被破壞，可有效保留產品的生物和化學結構及其活性的完整性[21-22]。在試驗的4種提取劑中，冷凍干燥的提取效果均優于相同條件下的熱風干燥，熱風干燥處理的樣品多酚提取率約是凍干處理的73%左右。

多酚物質極性較強，易溶于水和有機溶劑。本試驗采用使用最多的4種溶劑進行考察，根據相似相溶原理，發現丙酮的提取效果最好。Chavan Y等[23]對比了乙酸乙酯等8種提取劑，也證明丙酮對檳榔核多酚的提取更為有效。Paula Kuma[24]則在西芹多酚的提取試驗中發現丙酮水溶液僅對多酚總量的提取最好，對于單一成分來說并不一定是最合適的。這可能是由于丙酮與檳榔核多酚中的大多數成分極性更為相似，極性相似的溶劑可以使提取物充分溶于溶劑中從而被提取出來。同時以丙酮作為提取劑，對提取物的抗自由基能力可起到一定積極作用[25]。

2.2.2　丙酮體積分數對檳榔核多酚得率的影響

丙酮體積分數對檳榔核多酚得率的影響見圖2。

圖2　丙酮體積分數對多酚得率的影響Fig.2　Effect of acetone concentration on the extraction efficiency of polyphenols

從圖2可以看出，多酚提取率隨丙酮體積分數的增大先緩慢增加后快速減小，在50%時達到最大值，為39.53%。多酚在植物體內常與蛋白質等以氫鍵的形式形成穩定的復合物，丙酮體積分數過低，溶劑對氫鍵的破壞能力不強，從而使提取率降低；丙酮體積分數過高，溶劑極性低，導致提取率下降，并且會增加色素等脂溶性物質的溶出[26-27]，給后續的分離純化工作造成不便。因此，選擇50%的丙酮作為較佳提取劑濃度。

2.2.3　提取時間對檳榔核多酚得率的影響

提取時間對檳榔核多酚得率的影響見圖3。

圖3　提取時間對多酚得率的影響Fig.3　Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

從圖3可以看出，在90 min內，多酚提取率隨提取時間的延長先增加后減小，提取時間為50 min時多酚含量最大為41.04%。當提取時間繼續延長，提取液中的多酚含量緩慢下降，可能是因為長時間的高溫條件使多酚的分解速率大于了溶出速率。徐瑋等[28]通過正交試驗證明加熱時間控制在60 min以內，加熱溫度100℃～140℃，茶多酚的損失率可控制在15%以內。

2.2.4　提取溫度對檳榔核多酚得率的影響

提取溫度對檳榔核多酚得率的影響見圖4。

圖4　提取溫度對多酚得率的影響Fig.4　Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

從圖4可以看出，在40℃～80℃范圍內，多酚含量隨著溫度的升高而迅速升高，在70℃達到最大值，含量為40.96%。溫度進一步升高，高溫促使多酚類物質的氧化變性，因此，多酚含量有著明顯的下降，80℃多酚提取率同70℃多酚提取率有著顯著性差異（P＜0.05），因此，70℃是最佳提取溫度。Sólyom K 等[29]以葡萄渣和過濾液為例測試了不同溫度和加熱時間下的多酚分解狀況，相同條件下提取物的不同形態也會影響多酚的分解程度。

2.2.5　料液比對檳榔核多酚得率的影響

料液比對檳榔核多酚得率的影響見圖5。

由圖5可以看出，隨著液料比的增大，提取液中的多酚含量逐漸升高，在1∶40（g/mL）時達到最大，再提高料液比時多酚得率反而下降，液料比改變，提取液中的多酚含量的差異顯著（P＜0.05）。提高溶劑比例不但會增大不必要的溶劑成本，還會給后續濃縮提純帶來不便，因此選擇料液比為1∶40（g/mL）。

圖5　料液比對多酚得率的影響Fig.5　Effect of solid/liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.2.6　提取次數對檳榔核多酚得率的影響

提取次數對檳榔核多酚得率的影響見圖6。

圖6　提取次數對多酚得率的影響Fig.6　Effect of number of extractions on the extraction efficiency of polyphenols

多次提取可以增加提取液中的多酚含量，但會對后續的分離純化造成一定難度。由圖6可知，1次就能將檳榔核中的大部分多酚提出，重復一次還能獲得少量多酚。第3次、4次提取液中多酚含量少，且差異不顯著（P＜0.05）。本試驗中選擇提取一次，實際生產中可根據實際條件選擇1次～2次提取。

2.3　響應面試驗結果

2.3.1　Box-Behnken設計試驗結果與分析

響應面設計與結果見表2，表中1～24號為析因點，25號～29號為零點，重復5次，用以估計試驗誤差。以提取液中的多酚含量為響應值。

2.3.2　方差分析

回歸模型方差分析見表3。

運用Design-Expert軟件，對檳榔果核多酚提取率顯著影響因素進行響應面分析，得到檳榔果核多酚提取率（Y）的多元二次回歸模型：

表2　Box-Behnken試驗設計及結果Table 2　Box-Behnken experimental design matrix and results

表3　回歸模型方差分析Table 3　ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知，該回歸方程模型的P＜0.000 1，模型極顯著，而失擬項不顯著P=0.369 3＞0.05，試驗誤差??；模型相關系數R2=0.939 1，校正決定系數R2adj=0.878 2，表明該方程具有較好的模擬性，可用于優化試驗設計與結果分析，以確定丙酮提取檳榔核多酚的最優工藝條件。各因素對響應值影響大小順序為：料液比＞提取溫度＞丙酮體積分數＞提取時間。

一次項C、D均達到了極顯著的水平（P＜0.01），而A、B不顯著（P＞0.05），說明提取溫度和料液比對響應值影響較大，故要得良好的響應值，需要嚴格控制提取溫度和料液比。除AD之間的交互作用極顯著外，其余因素之間的交互因素并不顯著，其P值遠大于0.05，表明交互作用對響應值的影響較小。方差分析結果還顯示，C、D的二次項對響應目標值均有極顯著影響。

2.3.3　響應面分析

各因素交互作用對檳榔核多酚得率的影響見圖7。

圖7　各因素交互作用對檳榔核多酚得率的影響Fig.7　Interactive effects of various factors on the extraction efficiency of polyphenols

由圖7可知，開始時提取液中的多酚含量隨丙酮體積分數、料液比、提取時間和提取溫度水平的增大而增大，達到各因素中心值以后，得率隨各因素增大而逐漸減小。對比各圖可知，料液比和提取溫度對響應值的影響大，表現為圖7f的曲面較陡，由此可見，控制好料液比和提取溫度對取得良好的提取效果至關重要。而丙酮濃度和提取時間響應面相對較為平緩，說明該因素對得率影響較小。由圖7c可知，丙酮體積分數與料液比的交互因素較強外，其余各因素間的交互作用不強，表現為等高線為橢圓形，其余各圖的等高線橢圓形狀不明顯，這與回歸方程的方差分析結果一致，說明響應面優化設計可以較好地反映出丙酮體積分數、料液比、提取時間和提取溫度4個因素對檳榔核多酚提取情況的影響。

通過Design-Expert 8.0軟件分析計算可得到最佳提取工藝條件：丙酮體積分數50.49%、浸提溫度68.35℃、提取時間 47.69 min、料液比 1∶38.06（g/mL），在此條件下，回歸模型預測的多酚含量的理論值可達40.61%。

2.4　工藝條件的優化和驗證

由Design-Expert 8.0軟件得出的多酚的最佳提取條件為：丙酮體積分數50.49%、浸提溫度68.35℃、提取時間 47.69 min、料液比 1 ∶38.06（g/mL）。此條件下模型預測的最大得率為40.61%?？紤]到實際操作的局限性，將理論值修正為丙酮體積分數50%、浸提溫度 68℃、提取時間 48 min、料液比 1∶38（g/mL）。此條件下做驗證試驗，提取液的多酚得率為40.43%（即367.39mg/g，由多酚含量計算公式可得出），與理論值40.61%接近，說明該模型能較好地預測實際得率。韓林[5]用乙醇對檳榔核進行多酚提取，在最佳工藝參數下提取物的總酚含量為160.95mg/g。其優化條件是以檳榔殼作為試驗對象得到的，由于殼與核本身存在組織形態、成分含量的差別，故該條件并不一定是檳榔核的最適工藝，導致提取效率低于本試驗。Chavan Y等[23]采用旋轉振蕩法用丙酮提取產于印度的檳榔的果核多酚，在最佳工藝參數下得率為407.47mg/g，要高于本試驗提取效率。除了品種和產地原因外，也可能是由于振蕩加強了提取劑與檳榔粉末的接觸，更大程度的滲透進檳榔的細胞組織，促進了多酚的擴散效率。可見旋轉振蕩和超聲處理對于多酚提取是一種有效的輔助手段，在后續試驗中可以嘗試、驗證。

3　結論與討論

本研究優化了丙酮提取檳榔核多酚的工藝參數，其中各因素對得率的影響大小順序為：料液比＞提取溫度＞丙酮體積分數＞提取時間。按實際情況優化后的最佳工藝條件為丙酮體積分數50%、浸提溫度68℃、提取時間 48 min、料液比 1 ∶38（g/mL），在此條件下，檳榔核多酚得率達到最大值40.43%，與理論預測值基本一致。本提取過程中未采用任何輔助方法，在與其他研究結果比較中發現超聲輔助的空化作用[30]和微波輔助的高能效果[31]都能在一定程度上提高效率。試驗中可根據試驗條件添加輔助方式。本試驗作為基礎研究可為檳榔核多酚的深入研究提供數據支持。

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