響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇多糖提取工藝

揣東華，王洪杰，張勝抗，張平平，2

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii var.），又名刺芹側(cè)耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鮑魚(yú)的口感而得名[1]。杏鮑菇菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，適合保鮮、加工，杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及鈣、鎂、銅、鋅等礦物質(zhì)，深得人們的喜愛(ài)[2]。但杏鮑菇下腳料經(jīng)常被丟棄，價(jià)格便宜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與杏鮑菇差別較小，還含有多糖等活性物質(zhì)，具有提高人體免疫力、抗癌、降血脂、潤(rùn)腸胃等作用[3]。為深入開(kāi)發(fā)利用這一食用菌資源，本文對(duì)杏鮑菇內(nèi)多糖的提取條件進(jìn)行了研究，通過(guò)酶解提高杏鮑菇水溶性多糖的提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇水溶性多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采取杏鮑菇下腳料提取多糖，確定杏鮑菇多糖提取工藝的最佳參數(shù)，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考[4]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

杏鮑菇下腳料：天津市物美超市；濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇：天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；纖維素酶：北京索萊寶科技有限公司；酸性蛋白酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；試劑均為分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

FA2004電子精密天平：上海菁華科技儀器有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海瀘西分析儀器廠有限公司；CA-1111全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司。

1.3　方法

1.3.1　酶解杏鮑菇

取新鮮杏鮑菇清洗切片打漿（杏鮑菇∶水=1 g∶1 mL），分別取100 g杏鮑菇漿到錐形瓶中，沸水10 min（滅杏鮑菇內(nèi)酶），冷卻至室溫后加入一定量的纖維素酶與中性蛋白酶，水浴酶解一定時(shí)間后，沸水滅酶10 min，終止酶解[8]。

1.3.2　杏鮑菇多糖的提取

將酶解后的杏鮑菇漿抽濾取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原濾液的1/3后，以1∶3的體積比加入無(wú)水乙醇，4℃過(guò)夜，4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，所得沉淀用無(wú)水乙醇反復(fù)清洗3次，60℃烘干，得粗多糖[9]。

1.3.3　多糖得率的計(jì)算

采用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量[6]。

杏鮑菇多糖得率/%=多糖含量/杏鮑菇重量×100

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗(yàn)

2.1.1　酶解pH值的確定

pH值對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　pH值對(duì)多糖得率的影響Fig.1　Effect of pH on the yield of polysaccharides

由圖1可知，pH5.5時(shí)纖維素酶酶解杏鮑菇的多糖得率達(dá)到最大，所以纖維素酶酶解多糖的最佳pH為5.5。pH6.5時(shí)中性蛋白酶酶解杏鮑菇達(dá)到最高點(diǎn)，中性蛋白酶的最佳酶解條件為pH6.5。

2.1.2　酶添加量的確定

纖維素酶加量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖2，中性蛋白酶加量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖2　纖維素酶加量對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effect of enzyme addition on yield of cellulase

圖3　中性蛋白酶加量對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Effect of enzyme addition on yield of neutral protease

由圖2可知，纖維素酶的添加量在0.9%時(shí)多糖得率最大，所以選擇0.9%為纖維素酶的添加量。由圖3可知，中性蛋白酶的添加量在0.2%時(shí)多糖得率最大，故選擇0.2%為中性蛋白酶的添加量。

2.1.3　酶解時(shí)間的確定

酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，多糖得率都在3 h達(dá)到最大值，所以纖維素酶與中性蛋白酶的酶解時(shí)間選擇3 h為較宜酶解時(shí)間。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Effect of enzymolysis time on yield of polysaccharides

2.1.4　酶解溫度的確定

酶解溫度對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5　酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5　Effect of enzymolysis temperature on yield of polysaccharides

由圖5可知，隨著酶解溫度的增加，多糖得率都在50℃達(dá)到最大，所以纖維素酶和中性蛋白酶的最佳酶解溫度都為50℃。

2.1.5　復(fù)合酶添加量的確定

由單因素試驗(yàn)結(jié)果確定纖維素酶與蛋白酶的最佳酶解條件相似，所以選擇pH5.5，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度50℃。復(fù)合酶加量按纖維素酶0.45%和中性蛋白酶0.1%、纖維素酶0.6%與中性蛋白酶0.15%、纖維素酶0.9%與中性蛋白酶0.2%，找到最佳復(fù)合酶的添加量。復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6　復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.6　Effect of the amount of compound enzyme on the yield of polysaccharides

由圖6可知，單因素2.1.2比例混合的多糖得率最大，所以選擇纖維素酶0.9%與中性蛋白酶0.2%來(lái)作為復(fù)合酶的添加量。

2.2　響應(yīng)面優(yōu)化法分析酶解杏鮑菇提取多糖的最佳方法

2.2.1　響應(yīng)面優(yōu)化提取方式

根據(jù)酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值4個(gè)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍，以多糖得率為響應(yīng)值，采用 Disign-Expert軟件中的 Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)了四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1　響應(yīng)面因素水平表Table 1　Level of response surface factors

2.2.2　試驗(yàn)表及結(jié)果

將響應(yīng)面因素水平表輸入Disign-Expert軟件中，得出以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表2），根據(jù)表格設(shè)計(jì)試驗(yàn)并得出試驗(yàn)結(jié)果Y，試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w系數(shù)（表3），因素交互影響三維圖（圖7）。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Response surface design table and experimental results

續(xù)表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2　Response surface design table and experimental results

表3　響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)回歸模型系數(shù)表Table 3　Response surface optimization experimental regression model coefficient table

圖7　各因素交互對(duì)多糖得率的影響Fig.7　Effect of interaction of factors on yield of Polysaccharides

由表4方差分析得知，回歸模型的F-檢驗(yàn)極顯著（P≤0.01），說(shuō)明所擬合的二次回歸方程合適。回歸方程的A（酶添加量）、B（酶解溫度）、C（酶解時(shí)間）、D（pH值）、A2、C2、D2對(duì)多糖得率的影響顯著（P≤0.01）。根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖（圖7），直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。圖7所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，拋物面開(kāi)口向下，說(shuō)明所擬合的回歸模型有極大值點(diǎn)。從上述回歸模型中求得最優(yōu)條件：酶添加量纖維素酶0.9%與中性蛋白酶0.2%，酶解溫度48.8℃，酶解時(shí)間2.81 h，pH值為5.439。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)最佳工藝條件的驗(yàn)證見(jiàn)表5。

預(yù)測(cè)多糖得率最大值3.24%。由表5可見(jiàn)實(shí)際與預(yù)測(cè)的多糖得率較為接近。

3　結(jié)論

杏鮑菇是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的食用和藥用價(jià)值都很高的食用菌，但其子實(shí)體生產(chǎn)周期長(zhǎng)、價(jià)格高，如從中提取多糖物質(zhì)，成本較高，從而影響杏鮑菇多糖的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，而利用下角料生產(chǎn)多糖活性物質(zhì)，具有價(jià)格便宜、易采購(gòu)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。研究杏鮑菇多糖的提取，可為深入開(kāi)發(fā)利用這一食（藥）用菌資源提供參考。本文首先通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了杏鮑菇多糖提取參數(shù)的適宜水平范圍，然后，采用響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇內(nèi)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。獲得杏鮑菇多糖提取的最佳工藝參數(shù)為：酶添加量纖維素酶0.9%、中性蛋白酶0.2%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h、pH5.5，提取1次，在該工藝條件下杏鮑菇多糖得率達(dá)3.12%。

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