密蒙花黃酮的純化及抗氧化活性研究

劉景玲，李匡元，陳惜燕，李彥，毛仁俊，梁宗鎖，3，*

（1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100；2.陜西萬盛健康產業有限公司，陜西西安710000；3.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州310018）

密蒙花（Buddlejae flos）為馬錢科醉魚草屬（Buddleja）植物密蒙花（Buddieja officinalis Maxim.）的干燥花蕾和花序，于春季花未開放時采收，除去雜質、干燥而成；具有清熱瀉火、養肝明目、退翳之功效，用于目赤腫痛、多淚羞明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花[1]。因密蒙花富含黃色素，在中國西南地區被少數民族用于染飯，又稱“染飯花”[2]。現代藥理學研究表明，密蒙花提取物具有調節干眼淚腺局部炎癥[3]，保護免疫系統[4]，抗氧化和抗菌[5]，抗白血病[6]，抑制主動脈血管平滑肌細胞增殖[7]，抑制成骨細胞功能障礙[8]等多種功能。密蒙花化學成分復雜，已有研究報道其含有苯乙醇苷、黃酮類、環烯醚萜類等化合物[5，7]，其黃酮類成分作為植物三大次生代謝產物之一，具有保肝、抗炎、降血脂和降血糖等多種生物活性[8-10]；其苯乙醇苷類成分具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種生理功能[11]。鑒于此，密蒙花黃酮的提取工藝、含量測定及生物活性被廣泛研究，但未見純化工藝的相關報道。

大孔吸附樹脂法被廣泛應用于黃酮類[12]、多酚類[13]和色素[14]等植物化學物質的純化，具有工藝簡單、純化效率高、生產成本低廉等優點[15]。因此，本研究采用超聲波輔助有機溶劑法對密蒙花黃酮進行提取，以大孔吸附樹脂法純化，考察其最佳樹脂類型，優化其吸附及解吸附條件，為經濟高效制備密蒙花黃酮提供參考；以紫外可見分光光度法測定總黃酮含量，以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定毛蕊糖苷和蒙花苷含量，以DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）和銅離子還原能力（cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC）綜合測定密蒙花抗氧化活性，旨在評價其純化工藝可行性，促進密蒙花黃酮的開發與利用。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

密蒙花：安徽亳州藥材市場，經西北農林科技大學梁宗鎖教授鑒定為馬錢科醉魚草屬密蒙花的干燥花蕾和花序，45℃烘干后粉碎，過65目篩，于-20℃保存備用。

ADS-17、D-101、HPD-100、X-5 及 AB-8 型大孔吸附樹脂：安徽三星樹脂科技有限公司；蘆丁分析標準品：上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪、新亞銅、抗壞血酸、毛蕊糖苷、蒙花苷分析標準品：美國Sigma-Aldrich公司；其余化學試劑為國產分析純；水為去離子水。

1.2　儀器與設備

UV-1700紫外-可見分光光度計：日本株式會社島津制作所；SB25-12DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；高效液相色譜儀[1525雙元泵，Waters 2487 DAD檢測器，色譜柱為XBridge?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]：Waters（THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE）。

1.3　方法

1.3.1　粗提物制備

取密蒙花粉末適量，以1∶20（g/mL）料液比加入80%乙醇，過夜浸泡，于40 kHz條件下超聲波提取3次，每次30 min，轉速8 000 r/min離心5 min，上清液于4℃保存備用。

1.3.2　總黃酮含量測定

采用改良的亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉顯色法[16]測定總黃酮含量。以蘆丁作為標準對照品，繪制標準曲線，得到A506（Y）與蘆丁分析標準品質量濃度（X）的回歸方程：Y=0.119 2X+0.062（R2=0.971 2），樣品總黃酮含量以蘆丁標準曲線計算。

1.3.3　蒙花苷和毛蕊糖苷含量測定

1.3.3.1　對照品溶液制備

精密稱取毛蕊糖苷和蒙花苷分析標準品適量，以80%甲醇為溶劑，分別配制質量濃度為1mg/mL毛蕊糖苷和蒙花苷溶液，40 kHz條件下超聲波提取30 min，轉速8 000 r/min離心5 min，上清液按照1∶1（體積比）混勻，制備混合標準溶液，過0.45 μm濾膜，濾液于4℃保存，用于進樣分析。

1.3.3.2　樣品溶液制備

精密稱取密蒙花粉末適量，以80%甲醇為溶劑，配制質量濃度為10mg/mL的樣品溶液，按照1.3.1制備樣品用于分析。

1.3.3.3　線性關系考察

以80%甲醇為溶劑，分別精密配制（質量濃度為0、40、80、120、160、200 μg/mL）毛蕊糖苷溶液和（質量濃度為 0、10、20、30、40、50 μg/mL）蒙花苷溶液，40 kHz條件下超聲波提取30 min，8 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm濾膜，濾液于4℃保存，用于進樣分析。

1.3.3.4　洗脫程序

流動相0.02%磷酸-水（A）和乙腈（B）以1 mL/min的流速進行梯度洗脫：0～6 min：20%B；7 min～13 min：30%B；13 min～18 min：40%B；18 min～25 min：60%B。進樣量10 μL，檢測波長327 nm，柱溫25℃。

1.3.4　大孔樹脂篩選

大孔吸附樹脂的處理過程參照文獻[17]進行。以不同類型樹脂的飽和吸附量和解吸附率為指標，篩選最佳樹脂類型：稱取2 g已處理的樹脂，分別加入100 mL黃酮質量濃度為6mg/mL的密蒙花粗提物溶液，置于恒溫搖床中，25℃、轉速60 r/min振搖24 h，過濾并測定吸附后溶液黃酮質量濃度；達到吸附飽和后，以去離子水將飽和樹脂沖洗干凈，加入95%乙醇進行充分振搖，使黃酮充分解吸附，過濾并測定溶液黃酮質量濃度。樹脂對黃酮的吸附量和解吸附量參照文獻[15]公式進行計算，最終求得解吸附率。

1.3.5　動態吸附考察

將篩選好的樹脂進行濕法裝柱，以去離子水充分平衡，將總黃酮質量濃度分別為1.5、3、4.5、6、7.5mg/mL、的粗提物溶液以2 BV/h的流速分別上樣吸附，以0.5BV流出液為單位，連續收集，測定流出液總黃酮質量濃度，通過計算吸附量和吸附率，確定最佳上樣濃度。

在最佳上樣濃度條件下，分別以1、2、3、4、5 BV/h流速上樣吸附，以0.5 BV流出液為單位，分別連續收集，測定流出液黃酮質量濃度。當流出液質量濃度達到上樣質量濃度的1/10時，認為已達到樹脂泄露點，不宜再上樣，以此確定上樣流速及上樣質量濃度[15]。

1.3.6　動態解吸附考察

制備最優吸附條件下的飽和樹脂柱5份，用80%乙醇溶液作溶劑，分別以 0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h 的流速進行解吸附，以0.1 BV流出液為單位，分別連續收集，測定流出液總黃酮質量濃度，根據解吸附量和解吸附率確定最佳解吸附流速；以流出液基本不含總黃酮為指標，確定解吸附劑用量。

在最佳解吸附流速及用量條件下，分別用60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液，按照1 BV/h的流速對飽和樹脂進行解吸附，以0.1 BV流出液為單位，分別連續收集解吸附溶液，根據解吸附量和解吸附率確定最佳解吸附溶劑。

1.3.7　密蒙花粗提物的純化

取預處理好的X-5型樹脂，裝柱，將總黃酮質量濃度為6.00mg/mL的密蒙花粗提物水溶液以流速2 BV/h上樣20 BV。達到飽和吸附后，以去離子水除去雜質；以80%乙醇作解吸附溶劑，用量2 BV；以流速1.5 BV/h進行解吸附，收集解吸附溶液，減壓濃縮，凍干，得到密蒙花純化物。

1.3.8　抗氧化活性考察

1.3.8.1　DPPH自由基清除活性

以抗壞血酸作為標準對照品，參照文獻[15]的方法進行測定，按照公式計算DPPH自由基清除率和半數抑制濃度。

1.3.8.2　ABTS+自由基清除活性

以抗壞血酸作為標準對照品，參照文獻[18]的方法進行測定，按照文獻[15]的公式計算自由基清除率和半數抑制濃度。

1.3.8.3　鐵離子還原能力

以抗壞血酸作為標準對照品，參照Benzie[19]的方法，繪制標準曲線，得到A593（Y）和抗壞血酸質量濃度（X）的回歸方程：Y=9.020 5X+0.133（R2=0.995 7），各樣品以同法測定。

1.3.8.4　銅離子還原能力

以抗壞血酸作為標準對照品，參照 Bektas，ogˇlu[20]的方法，繪制標準曲線，得到A450（Y）和抗壞血酸質量濃度（X）的回歸方程：Y=0.775 2X+0.071 4（R2=0.998 3），各樣品以同法測定。

1.3.9　數據處理與分析

本研究所用全部數據均平行測定3次，結果以x±s表示，采用SPSS 22.0對數據進行配對樣本T檢驗，其中P＜0.01認為組間具有極顯著差異，相關性分析采用Pearson相關。

2　結果與分析

2.1　大孔吸附樹脂篩選

考察 ADS-17、D-101、HPD-100、X-5、AB-8 這 5類大孔吸附樹脂對密蒙花總黃酮的吸附及解吸附效果，以確定最佳樹脂類型。不同類型樹脂的物理特性、飽和吸附量及解吸附率見表1。

由表1可知，除ADS-17型樹脂外，其余4種樹脂均表現出較強的吸附能力，其中X-5型樹脂的吸附能力最強。這可能與樹脂特性有關，一般認為，樹脂的極性、比表面積和孔徑大小對吸附性能均產生影響[21]。解吸附率表明，5種類型樹脂均表現出較強的解吸附能力，但X-5型樹脂的解吸附能力最強。許多研究表明，X-5型樹脂對小米棗（Ziziphus Mill.）黃酮、豆腐柴（Premna microphylla Turcz）葉黃酮和山杏（Siberian Apricot）花黃酮[22-24]均具有良好的純化效果。因此，綜合考慮吸附和解吸附能力，選擇X-5樹脂用于密蒙花總黃酮的純化。

表1　不同大孔吸附樹脂對密蒙花總黃酮的吸附及解吸附能力Table 1　Adsorption and desorption capacity of different macroporous adsorption resins for the total flavonoids of the Buddlejae flos

2.2　上樣質量濃度與上樣流速對密蒙花總黃酮吸附的影響

考察密蒙花粗提物上樣質量濃度和上樣流速及用量對X-5型樹脂吸附效果的影響，以總黃酮吸附量和吸附率為指標，結果如圖1所示。

上樣質量濃度對樹脂吸附效果的影響如圖1（A）所示。在1.5mg/mL～6.0mg/mL上樣濃度范圍內，總黃酮吸附量隨上樣濃度的逐漸增加而迅速增加，從29.82mg/mL上升至114.38mg/mL；與此同時，吸附率緩慢下降，從99.40%減少至95.32%。在6.0mg/mL～7.5mg/mL上樣濃度范圍內，總黃酮吸附量增加緩慢（114.38mg/mL～127.68mg/mL），而吸附率隨著上樣濃度的增加迅速下降（95.32%～85.12%）。分析可能的原因是：當上樣濃度較低時，樹脂對總黃酮的吸附能力尚未達到飽和狀態，隨著上樣質量濃度的增加吸附率也持續增加；而當樹脂對黃酮的吸附能力逐漸接近飽和時，其吸附能力減弱，樹脂對黃酮的吸附增加緩慢，而吸附率卻迅速下降。綜合考慮樹脂對總黃酮的吸附量和吸附率的影響，選擇6.0mg/mL為上樣最適濃度。

圖1　上樣質量濃度（A）及樣品上樣流速（B）對樹脂吸附密蒙花總黃酮效果的影響Fig.1　The influence of sample loading concentration（A）and sample loading flow rate（B）on dynamic adsorption for the total flavonoids of the Buddlejae flos

上樣流速對樹脂吸附效果的影響如圖1（B）所示。在1 BV/h～5 BV/h范圍內，隨著流速的增加，樹脂對黃酮的吸附量和吸附率均呈現出逐漸降低的趨勢。在3 BV/h后迅速降低，可能是因為流速過快，導致黃酮分子與樹脂接觸時間短，以至不能充分吸附；但流速過慢，耗時較長，影響生產效率。綜合考慮，選擇2BV/h作為上樣最佳流速，在此條件下，根據上樣泄露點，確定最佳上樣體積為20 BV。

2.3　洗脫流速及不同溶劑對密蒙花總黃酮解吸附的影響

考察解吸附流速及用量和不同溶劑對X-5型樹脂解吸附效果的影響，以總黃酮解吸附量和解吸附率為指標，結果如圖2所示。

圖2　洗脫流速（A）及乙醇濃度（B）對樹脂解吸附密蒙花總黃酮效果的影響Fig.2　The influence of eluent flow rate（A）and the ethanol concentration（B）on dynamic desorption for the total flavonoids of the Buddlejae flos

洗脫流速及用量的結果如圖2（A）所示。在0.5BV/h～2.5 BV/h解吸附流速范圍內，黃酮解吸附量和解吸附率均表現出先增加后降低的趨勢，在洗脫流速為1.5 BV/h時，二值達到最高點，解吸附量為107.94mg/mL，解吸附率為94.37%。隨后，解吸附量和解吸附率均表現出明顯下降趨勢。可能由于在一定流速范圍內，樹脂對總黃酮的解吸附能力隨流速的增加而加強，當流速過快時，樹脂與解吸附溶劑接觸時間短，解吸附不充分，以至解吸附量和解吸附率均降低。因此，選擇1.5 BV/h作為最佳洗脫流速，在此條件下，以解吸附流出液中基本不含總黃酮為指標，解吸附溶劑用量確定為2 BV。

不同濃度乙醇對解吸附影響的結果如圖2（B）所示。在60%～100%乙醇體積分數范圍內，樹脂對黃酮的解吸附量和解吸附率一致，呈現出先增加后減少的趨勢，在80%乙醇解吸附條件下，二者達到最高點，樹脂對總黃酮的解吸附率可達94.37%。這可能與密蒙花黃酮的極性有關，研究表明，80%乙醇對銀杏（Ginkgo biloba L.）葉和水芹（Oenanrhe javaniea）[25-26]所含黃酮均表現出良好的提取效果，綜合考慮解吸附量和解吸附率，選擇80%乙醇作為最佳洗脫溶劑。

2.4　HPLC法測定密蒙花中蒙花苷和毛蕊糖苷含量

以HPLC法分析了密蒙花指標性成分毛蕊糖苷和蒙花苷含量，毛蕊糖苷和蒙花苷標準品的HPLC圖譜如圖3A所示，其保留時間分別為10.2 min和18.1 min。本研究得到的最佳純化工藝條件下，密蒙花粗提物樣品的HPLC圖譜如圖3B所示，毛蕊糖苷（a）和蒙花苷（b）均呈單一對稱峰，基線穩定，所含物質明顯分離。

圖3　密蒙花中毛蕊糖苷（a）和蒙花苷（b）標準品（A）和密蒙花粗提物（B）的HPLC圖譜Fig.3　The chromatogram of the acteosid（a）and buddleoside（b）standards（A）and the crude extracts（B）of the Buddlejae flos

以毛蕊糖苷和蒙花苷標準品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線，見圖4。分別得到Y蒙花苷=488 93 X+598 5.6（R2=0.999 6）和 Y毛蕊糖苷=21 631X（R2=0.998 3），標準曲線的相關系數均大于0.99，說明所試標準品質量濃度與峰面積呈現較好的相關性。

圖4　毛蕊糖苷和蒙花苷標準曲線Fig.4　The standard curve of the acteoside and buddleoside

2.5　密蒙花粗提物中化學成分含量及其抗氧化活性分析

密蒙花中總黃酮、蒙花苷和毛蕊糖苷含量見表2。

表2　密蒙花中總黃酮、蒙花苷和毛蕊糖苷含量Table 2　The contents of the total flavonoids，buddleoside and acteoside in the Buddlejae flos

由表2可知，密蒙花粗提物總黃酮含量為40.22%，是具有開發潛力的黃酮資源植物。經本研究得到的工藝純化后，密蒙花中總黃酮含量顯著增加到91.62%，蒙花苷含量由粗提物中的2.63%增加到5.25%；毛蕊糖苷含量由8.97%增加到24.43%。相比于粗提物，密蒙花純化物中的總黃酮含量提高2.28倍，蒙花苷含量提高2.00倍，毛蕊糖苷含量提高2.72倍；純化效果顯著。

密蒙花粗提物及純化物的抗氧化活性結果如表3所示。

表3　密蒙花粗提物和純化物的抗氧化活性分析Table 3　The antioxidant capacity of the crude extract and the purified material of the Buddlejae flos

經純化后，其DPPH自由基清除活性和ABTS+自由基清除活性的半數抑制濃度（IC50，μg/mL）分別提高2.00倍和1.95倍，其能以低濃度發揮良好的抑制自由基效果；而CUPRAC和FRAP還原能力提高1.91倍和2.65倍。表明密蒙花粗提物經純化后，抗氧化活性顯著增強。

2.6　密蒙花總黃酮和抗氧化指標的相關性分析

為深入了解密蒙花總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性，對密蒙花純化物中總黃酮含量與DPPH自由基的清除活性、ABTS+自由基的清除活性、鐵離子還原能力和銅離子還原能力之間進行相關性分析。結果見表4。

表4　密蒙花總黃酮含量與抗氧化指標的相關性Table 4　The pearson correlation between the total flavonoids and the antioxidant indices of the Buddlejae flos

各抗氧化指標間均具有極顯著的相關性（P＜0.01），密蒙花總黃酮含量與4種抗氧化指標之間相關性極顯著，表明密蒙花總黃酮對其抗氧化活性有明顯作用。

3　結論

3.1　密蒙花總黃酮純化的最優工藝

采用大孔吸附樹脂法純化密蒙花黃酮，篩選其最優純化工藝為：上樣質量濃度6.00mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣量20 BV，解吸附流速1.5 BV/h，解吸附劑用量2 BV，80%乙醇解吸附效果最好。在此條件下，密蒙花黃酮經純化后，總黃酮含量由粗提物中的40.22%增加到91.62%，純化效果顯著且工藝可行。

使用HPLC分析密蒙花毛蕊糖苷和蒙花苷含量，經最優工藝純化后，毛蕊糖苷和蒙花苷含量分別提高2.72倍和2倍，說明純化工藝對毛蕊糖苷和蒙花苷同樣效果顯著。

3.2　黃酮對密蒙花抗氧化活性作用顯著

以DPPH自由基的清除活性、ABTS+自由基的清除活性、鐵離子還原能力和銅離子還原能力綜合考察黃酮的抗氧化能力有大量報道[27-29]，本文以上述4種抗氧化指標考察密蒙花純化前后抗氧化活性變化。結果表明，密蒙花粗提物本身具有較強的抗氧化活性，經純化后，其抗氧化活性顯著增強。相關性分析表明黃酮對密蒙花抗氧化活性起顯著作用，但其是否為密蒙花抗氧化活性的主要成分尚需進一步研究。

本研究結果可為密蒙花黃酮開發為化妝品、保健品及藥品等抗氧化劑提供理論基礎，促進密蒙花資源的開發利用。

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