HS-GC-MS法和SDE-GC-MS法分析杜氏鹽藻揮發性成分

王麗娟，劉曉燕，楊宋琪，徐衛民，羅光宏，*

（1.甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖734000；2.河西學院，甘肅張掖734000；3.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖734000；4.甘肅天光亮鹽藻有限責任公司，甘肅張掖734000）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）屬綠藻門，綠藻綱，團藻目，鹽藻科，鹽藻屬，是一種單細胞真核藻類，是迄今為止發現的最耐鹽的真核生物之一。杜氏鹽藻含有豐富的β胡蘿卜素、甘油、蛋白質、多糖、油脂、礦物質和必須氨基酸等[1-5]，具有很高的營養價值和藥用價值。其含有的天然胡蘿卜素具有抗氧化、抗腫瘤和提高機體免疫力等作用[6]。目前已應用于食品、醫藥保健品和化工等領域，并在我國內蒙古吉蘭泰和甘肅高臺鹽池地區已有大面積養殖。

藻類揮發性成分是一類成分復雜、功能不清的次生代謝物質，是引起水體氣味的重要因素，并對生活環境中其他物種生長產生重要影響[7-9]。研究表明揮發性成分在藻類生長發育、信息傳遞、化學感應、應急反應、抗鹽及自身防御等方面具有重要作用[10-12]。目前關于鹽藻揮發性成分僅有一篇報道為閆爽等[13]采用頂空固相微萃取和氣相色譜質譜聯用（headspace-solid phasemicroextraction-gas dnromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法分析杜氏鹽藻揮發性成分，而揮發性成分因種屬和提取方法而異。因此，本文采用頂空（Headspace，HS）直接進樣與同時蒸餾萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）對杜氏鹽藻的揮發性成分進行提取，結合氣相色譜-質譜（GC-MS）分析，以期更全面的詮釋杜氏鹽藻揮發性成分譜并對其進一步開發和應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

杜氏鹽藻由甘肅天光亮鹽藻有限責任公司提供。取穩定期杜氏鹽藻于4℃、11 000 r/min下離心收集，冷凍干燥后置于-80℃冰箱保存備用。二氯甲烷、石油醚（沸程60℃～90℃）和無水硫酸鈉均為分析純。

Trace GC 2000-DSQ氣質聯用儀：美國Thermo Scientific公司；HSS 86.50頂空進樣器：意大利DANI公司；JEA502電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；R-1001LN旋轉蒸發儀：鄭州長城科工貿有限公司；5804R型離心機：德國艾本德股份公司；EXF40086V超低溫冰箱：美國Thermo Scientific公司；同時蒸餾萃取裝置：安徽一洋實驗設備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.2　方法

1.2.1　頂空進樣法（HS）

取適量杜氏鹽藻粉放入頂空瓶約1/3高度處，加蓋密封。頂空瓶溫度120℃，加熱時間40 min，樣品環溫度140℃，傳輸線溫度160℃，進樣時間1 min。

1.2.2　同時蒸餾萃取法（SDE）

取10.00 g杜氏鹽藻粉置于裝置一端的1 L圓底燒瓶中，加適量水，電熱套加熱。裝置的另一端接盛有30 mL二氯甲烷的萃取瓶，60℃水浴加熱，同時蒸餾萃取4 h。冷卻，加入少許無水硫酸鈉去除水分，4℃冰箱靜置12 h，濃縮至3 mL，4℃保存供GC-MS定性分析。

1.2.3　色譜質譜條件

色譜條件：Thermo TR-35MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣。升溫程序為40℃保持3 min，以4℃/min速度升到150℃，保持1 min，以6℃/min速度升到250℃，保持5 min。不分流進樣，進樣口溫度220℃，傳輸桿溫度250℃。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度200℃，掃描范圍 29 m/z～500 m/z。

1.2.4　定性和定量分析

化合物經Mainlib和Replib譜庫檢索及人工解析確定其化學結構，用峰面積歸一化法計算其相對含量。

2　結果與分析

2.1　揮發性成分檢測結果

采用同時蒸餾萃取法和頂空進樣法對杜氏鹽藻的揮發性成分檢測結果見圖1和表1。

由表1可知，用SDE和HS法測出39種揮發性成分，包括烷烴類、芳香烴類、烯烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、酚類和呋喃類。其中SDE法檢測出29種，從表1可知有酯類3種（相對含量為31.94%）、烯烴類2種（23.96%）、醇類5種（12.97%）、烷烴類8種（10.03%）、酮類6種（8.88%）、芳香烴類3種（7.23%）和醛類2種（1.89%）。HS法檢測出19種，有烯烴類1種（20.18%）、酯類2種（18.79%）、烷烴類4種（13.72%）、醇類1種（7.18%）、醛類5種（4.13%）、酮類4種（3.97%）、酚類 1種（1.1%）和呋喃類1種（0.52%）。

圖1　杜氏鹽藻揮發性成分GC-MS總離子流Fig.1 GC-MS total ion chromatography of volatile compounds in Dunaliella salina

表1　杜氏鹽藻揮發性成分GC-MS分析結果Table 1　The result of GC-MS for volatile compounds of Dunaliella salina

續表1 杜氏鹽藻揮發性成分GC-MS分析結果Continue table 1　The result of GC-MS for volatile compounds of Dunaliella salina

SDE法檢測到的相對含量較大的成分是二氫獼猴桃內酯（27.50%）、8-十七碳烯（23.37%）、十七烷（6.71%）和鄰二甲苯（4.93%）。HS法檢測到相對含量較大的成分是8-十七碳烯（20.18%）、3-甲基-1-乙酸丁酯（17.25%）、3-甲基-1-丁醇（7.18%）和十七烷（6.21%）。

2.2　2種方法提取揮發性成分的比較

SDE法和HS法提取杜氏鹽藻揮發性成分比較見圖2。

圖2　SDE法和HS法提取杜氏鹽藻揮發性成分比較Fig.2　Comparison of volatile compounds in Dunaliella salina by SDE and HS method

由表1和圖2可知，在揮發性成分種類和數量方面，SDE法檢測出的酯類、烯烴類、醇類、酮類、烷烴類和芳香烴類成分種類數多于HS法檢測，而在檢測出的醛類、呋喃類和酚類成分種類數上，HS法多于SDE法；在揮發性成分的相對含量方面，SDE法檢測出的酯類、烯烴類、醇類、酮類和芳香烴類成分相對含量高于HS法，而檢測出的烷烴類、醛類、酚類和呋喃類上HS法高于SDE法。值得注意的是SDE法檢測出了芳香烴類物質，HS法未檢測出；而HS法檢測出了酚類和呋喃類物質，SDE法卻未測出該物質。這與文獻中檢測的規律基本一致[14]。

3　討論

3.1　揮發性成分討論

3.1.1　烴類化合物

在檢測出的所有揮發性成分中，烴類是含量最高的成分。主要是8-十七碳烯、十七烷烴和鄰二甲苯。鄰二甲苯具有芳香氣味。據報道，8-十七碳烯是大型海藻共有的特征風味物質[15-16]，同時十七烷烴和8-十七碳烯是紅毛菜屬藻類的特征性揮發性成分[15]。綠藻-大羽藻中的8-十七碳烯是一種化學感應物質，由生物體內酶促反應生成，在生物體愈傷過程中，可以作為生物信息素起一定作用[17]。十七烷烴的產生主要來自十八碳脂肪酸或十八碳醛轉化為十七烷烴和二氧化碳。除此之外，其它一些烷烴類化合物，特別是帶有支鏈的烷烴，一般均是由脂肪酸氧化降解而成，并且這種代謝途徑同時存在于植物和昆蟲動物中。如十四烷烴和十六烷烴在多種植物油中都能檢測到[18]。烴類化合物一般氣味閾值較高，對杜氏鹽藻的氣味貢獻不大。但本研究中經2種提取方法得到的8-十七碳烯的相對含量均達20%以上，故對杜氏鹽藻的氣味和作用值得進一步研究。

3.1.2　醇類化合物

醇類化合物一般氣味柔和，具有植物香。杜氏鹽藻中共檢測出5種，主要是脂肪醇類、脂環醇類和芳香醇類。脂肪醇類化合物普遍沸點較低易揮發，包括3-甲基-1-丁醇、順 9，12，15-十八碳三烯醇和 4，8-二甲基-1，7-壬二烯-4-醇。其中3-甲基-1-丁醇具有特殊不愉快氣味、有辛辣而令人厭惡味；而作為芳香醇的苯乙醇來自芳香族氨基酸的降解，具有玫瑰花香、紫羅蘭香、茉莉花香等多種氣味[19]。飽和脂肪醇類物質的閾值一般都較高，而不飽和脂肪醇的閾值相對較低，對氣味貢獻較大。醇類物質因氣味柔和對杜氏鹽藻的整體氣味有著有益影響。

3.1.3　酮類化合物

酮類化合物一般具有花果香味。杜氏鹽藻中共檢測出9種，其中α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮和異佛爾酮都是β-胡蘿卜素的降解產物[20-22]。烯酮類化合物一般具有青葉芳香[23]，如α-紫羅蘭酮具有甜花香味；β-紫羅蘭酮具有類似松木香，稀時類似紫羅蘭香，是維生素A的重要合成原料；異佛爾酮具有土香香韻；同時檢測到 4-[2，6，6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3丁烯-2-酮；此外，苯乙酮是芳香族氨基酸的降解產物，具有強烈的清甜花香和干草氣息[24]。這些物質對杜氏鹽藻的芳香味產生有利的影響。

3.1.4　醛類化合物

醛類化合物與形成各種特異香氣風格有密切關系[25]。杜氏鹽藻中共檢測出5種。其中β-環檸檬醛是β-胡蘿卜素的降解產物[20-22]，具有涼香、果香和清茶香。飽和直鏈醛一般帶有辛辣刺激味，隨著鏈長的增加刺激性程度減弱[26]。在生物體內，很多醛類物質都來自脂肪酸。如己醛和戊醛是亞油酸的氧化裂解產物，辛醛是油酸的氧化裂解產物[27]。脂肪醛大多呈現濃烈的果香風味，還帶有些許面包香氣[25]。如己醛具有強烈的青香和果香味；戊醛稀釋后有果香和面包香；辛醛稀釋后有似甜橙、蜂蜜樣氣味。醛類物質相對于其他揮發性成分來說閾值較低，可能對杜氏鹽藻的氣味貢獻較大。

3.1.5　酯類化合物

酯類化合物被認為是脂肪酸氧化降解產生的醇和小分子游離脂肪酸在微生物作用下通過酯化反應產生的[28]，大多數能給予食品一種果香或花香味。酯類化合物的氣味閾值一般較低，對杜氏鹽藻的整體氣味有重要貢獻。含量較高的二氫獼猴桃內酯又名5，6，7，7a-四氫-4，7，7a-三甲基-2-（4H）-苯并呋喃酮，來自β-胡蘿卜素的降解[20-22]，帶有香豆素樣香氣，并有麝香樣氣息；棕櫚酸甲酯有輕微果香味；月桂酸異戊酯具有微弱的油香和脂香。

3.1.6　其它化合物

2-烷基呋喃類化合物被認為是亞油酸氧化特有產物[29]，具有較高的氣味閾值。但2-戊基呋喃氣味閾值相對較低，是亞油酸9-羥基自由基裂解產物，具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻；香芹酚又名2-甲基-5-異丙基苯酚，具有百里香油似的辛辣氣味。

從杜氏鹽藻揮發性成分的相對含量來看，個別烴類和酯類化合物的含量顯著高，而大多數揮發性成分的含量均較低。在高含量的揮發性成分中，烴類成分呈無味或氣味閾值較高，推測對杜氏鹽藻的整體氣味貢獻率較低，或是通過與其他揮發性成分互作效應而間接促進氣味的形成[30]。值得一提的是，雖然其他揮發性成分含量不高，但由于他們的氣味閾值較低，往往在低濃度下也能表現出顯著的香味[31]。如呈現松木香、紫羅蘭香的β-紫羅蘭酮在水中的氣味閾值僅為0.007 μg/L，是已報道的茶的特征性成分之一[32]；另外散發豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜香韻的2-戊基呋喃閾值為6 μg/L；高度稀釋下有類似甜橙、蜂蜜樣香氣的辛醛也有較低閾值0.7 μg/L，這些化合物可能對杜氏鹽藻的整體氣味有一定貢獻。

與文獻[13]相比，本研究不僅檢測到了文獻報道的β-胡蘿卜素的降解產物如α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、異佛爾酮和β-環檸檬醛以及酚類物質香芹酚、呋喃類物質2-戊基呋喃和酮類物質4-[2，6，6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3丁烯-2-酮。而且檢測到了一些揮發性烴類成分如十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和8-十七碳烯等。雖然這些成分在杜氏鹽藻中未見報道，但在螺旋藻、銅綠微囊藻和一些綠藻、硅藻、海藻中均有報道[21，25，33-35]。除此之外，檢測到一些酯類成分如二氫獼猴桃內酯、棕櫚酸甲酯和月桂酸異戊酯。而文獻中報道的吡嗪類物質2，6-二乙基-吡嗪和酸類物質2-對叔丁苯氧甲基-5-叔丁基-3-呋喃甲酸并未檢測到。同時檢測到的醇類、酮類和醛類成分與文獻中不盡相同。究其原因，可能與杜氏鹽藻的產地以及揮發性成分的提取方法有一定的關系。鄧國賓等[36]發現光照對銅綠微囊藻揮發性成分有影響。陳嬌等[37]發現3種海洋硅藻在不同培養階段揮發性成分的種類和數量均有變化。李微等[38]發現壇紫菜的揮發性成分有明顯的品種和地區性差異。

3.2　提取方法討論

SDE法是將水蒸氣蒸餾與有機溶劑萃取合二為一，是揮發性成分的經典提取方法，也是目前應用最廣泛的方法。藻液與萃取溶劑同時加熱，進行連續多次的萃取。這種方法的優點是操作簡單方便，提取出的揮發性成分種類較多且總量較高[39]。這與本研究結果一致。缺點是持續高溫加熱可能會造成一些揮發性成分的熱解和氧化。萃取溶劑考察了二氯甲烷和石油醚，發現二者萃取出的揮發性成分在含量上無顯著差異，但種類上二氯甲烷較多，故選擇二氯甲烷為提取試劑。HS法是將未經溶劑預處理的樣品置于頂空瓶中，經過加熱，使樣品中的揮發性成分直接進入GCMS分析系統。該方法具有快速、自動化程度高、樣品消耗量少、揮發性成分損失少等優點[40]。比較兩種提取方法，HS法有利于提取沸點較低易揮發性化合物，而SDE法對高沸點揮發性較低的化合物有利，低沸點的化合物萃取較少[41-42]。如本研究中SDE法除了得到低沸點的醇類、醛類外，還有高沸點的酯類。因此兩種方法相互補充，能更加全面的分析杜氏鹽藻中的揮發性成分。

4　結論

采用SDE和HS兩種方法提取杜氏鹽藻中的揮發性成分，共檢測出39種化合物。其中SDE法檢測出29種，HS法檢測出19種。SDE法檢測出烷烴類8種、酮類6種、醇類5種、芳香烴類3種、酯類3種、烯烴類2種和醛類2種。HS法檢測出烷烴類4種、酮類4種、醇類1種、酯類2種、烯烴類1種、醛類5種、酚類1種和呋喃類1種。SDE法檢測到相對含量較高的成分是二氫獼猴桃內酯（27.50%）、8-十七碳烯（23.37%）、十七烷（6.71%）和鄰二甲苯（4.93%）。HS法檢測到相對含量較高的成分是8-十七碳烯（20.18%）、3-甲基-1-乙酸丁酯（17.25%）、3-甲基-1-丁醇（7.18%）和十七烷（6.21%）。兩種方法相互結合，能對杜氏鹽藻揮發性成分進行更為全面的分析。但檢測到的揮發性成分哪些是杜氏鹽藻的主要特征風味物質仍需進一步研究。

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