高效凝膠色譜法同時測定普魯蘭多糖生物合成過程中分子量和含量

安超，薛文嬌，馬賽箭，丁浩

（陜西省微生物研究所，陜西西安710043）

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）發酵產生的細胞外純天然高分子多糖，是一種新型可降解生物材料。該多糖是以α-1，6-糖苷鍵連接的聚麥芽三糖，一般沒有分支結構，是直鏈多糖，具有良好的生物相容性。近年來，普魯蘭多糖在藥物載體、藥物控釋、生物材料（如水凝膠、人工骨）等方面被廣泛研究及應用。這些領域的開發將直接提升普魯蘭多糖的價值，但同時也對普魯蘭多糖分子量大小和分布提出了更高的要求。商品化的普魯蘭多糖重均分子量只有兩種規格，分別為200 kDa和300 kDa，這在很大程度上限制了普魯蘭多糖在生物醫藥中應用。

普魯蘭多糖分子量的范圍在1.5×104Da～1.0×107Da之間，其主要受生產菌種和發酵條件影響[1]。研究發現，普魯蘭多糖發酵培養基組成和發酵周期是影響普魯蘭多糖分子量大小的主要因素[2-4]，特別是在發酵過程中，普魯蘭多糖分子量是一個動態的變化。一般而言，聚合物分子量的測定可以通過黏度法、小角激光光散射法和凝膠色譜法[5-6]。在出芽短梗霉發酵生產普魯蘭多糖的過程中，傳統的普魯蘭多糖分子量和含量檢測方法需要首先獲得普魯蘭多糖干燥固體，進而通過稱重法和高效凝膠色譜法分別測定發酵過程中普魯蘭多糖產量和分子量[7]，其中，干燥的過程需要1天時間，這種方法不能實時監控發酵過程中普魯蘭多糖的分子量和含量。為了實現在發酵過程中同步檢測普魯蘭多糖的含量和分子量大小，在本研究中，通過建立一種快速的檢測方法，直接利用發酵液通過高效凝膠色譜法同時檢測出芽短梗霉發酵液中普魯蘭多糖的含量和分子量大小，這為精準控制普魯蘭多糖發酵過程中普魯蘭多糖分子量及含量提供可靠技術手段。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1　菌株

低色素分泌的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）CGMCC No.11602，由陜西省微生物研究所代謝產物研究中心選育獲得，目前，以專利菌株形式保藏于中國普通微生物保藏中心。

1.1.2　培養基

種子培養基（g/L）：葡萄糖 50 g，酵母粉 2.5 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 1.0 g，K2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 L，初始 pH 6.5。

發酵培養基（g/L）：蔗糖50 g，酵母粉2.5 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 1.0 g，K2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 L，初始 pH 6.5。

1.1.3　標準物質

不同分子量普魯蘭多糖的標準物：Sigma公司，具體如表1所示。

表1　不同分子量普魯蘭多糖標準品Table 1　The pullulan standard with different molecular weight

1.1.4　試劑

無水乙醇（分析純）：天津天力化學試劑有限公司，硝酸鈉（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2　儀器與設備

生化培養箱SPX-250：北京科偉永興儀器有限公司；恒溫搖床ZWY-2102：上海智城分析儀器制造有限公司；冷凍離心機 5804R：Eppendorf co.，LTD；萬分之一天平 BSA 2245（Sartorius co.，LTD），4×5L 發酵罐：上海寶興生物儀器有限責任公司；高效凝膠色譜儀1515-2424、保護柱（UltrahyfrogelTM6×40 mm）和凝膠柱（UltrahydrogelTMLinear 7.8×300 mm）：Waters Chromatography，Inc。

1.3　方法

1.3.1　普魯蘭多糖發酵

平板活化：將4℃斜面保藏的出芽短梗霉SWP35接種于PDA平板上，28℃培養5 d。

種子培養：將活化好的菌種接種于種子培養液，28℃，1 230 r/min搖床培養2 d。

發酵罐培養：按照5%的接種量，將培養好的種子液接種于裝有3 L發酵培養液的5 L玻璃發酵罐中，培養溫度28℃，轉速400 r/min，通氣量1vvm，尾壓0.05 Mpa。

1.3.2　普魯蘭多糖產量及分子量測定

在發酵過程中，每24h取樣一次，每次取樣30mL，裝入50mL離心管中，通過轉速10000r/min，離心6min去除菌體，然后取上清液15 mL加入30 mL預冷的無水乙醇沉淀，4℃維持12 h，最后通過轉速8 000r/min，離心6 min，獲得酒精沉淀物，最后通過80℃烘干，通過稱重法計算發酵液中普魯蘭多糖含量[8]。

式中：Mg為總重，g；Me為離心管空重，g。

根據傳統的分子量測定方法，通過烘干獲得的粗多糖被研磨成粉，并且用水配制成1mg/mL的溶液，然后通過高效凝膠色譜法進行測定。在本研究中，通過對發酵過程中發酵液上清液進行合理稀釋，然后通過高效凝膠色譜法同時測定普魯蘭多糖的含量和分子量。

1.3.3　高效凝膠色譜測定普魯蘭多糖的方法

流動相 0.1 mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫30℃，示差折光檢測器檢測（Waters 2424），進樣量20 μL，所有的測試結果通過Breeze軟件（Waters Chromatography，Inc）積分處理[9]。

1.3.4　普魯蘭多糖標準曲線測定

根據文獻報道[10]，使用6個1mg/mL水溶液的普魯蘭多糖分子量標準品（Mw范圍：9600Da～2350000Da），依據上述測試方法進行分子量的測定，通過儀器自帶的Breeze軟件進行標準曲線繪制。普魯蘭多糖含量的標準曲線則采用3個已知分子量（Mp：6 100 Da，47 100 Da，642 000 Da），且已知濃度（0.2mg/mL～1.0mg/mL）的普魯蘭多糖標準品進行測定，通過對其峰面積積分進行標準曲線繪制。

1.3.5　準確性和重復性

準確性：根據上述測試方法，分別對已知濃度、已知分子量的兩個不同分子量普魯蘭多糖標準品的水溶液進行6次測試。錯誤率被用來描述實際測試樣品的分子量（Mwo）與原始樣品的分子量（Mw）之間的誤差關系，具體計算方法為：

回收率被用來評估方法的準確性，通過比較測試樣品含量（Co）和原始樣品含量（Cn）之間的比值來計算。具體的計算方法如下：

重復性：通過對兩組普魯蘭多糖標準液進行6個平行樣本的測試數據，計算出RSD%（相對標準偏差）。

1.3.6　分析方法

所有的檢測都設置3個重復試驗，數據通過Origin Pro 8（OriginLab Corporation，Northampton，USA）軟件進行方差分析，使用Tukey法進行不同樣本在95%置信水平平均值之間的統計學差異比較。

2　結果與討論

2.1　普魯蘭多糖分子量標準曲線的測定

根據分子量大小差異，6個不同分子量普魯蘭多糖標準品被分為2組，配制成混合水溶液進行高效凝膠色譜檢測，結果如圖1所示。

圖1　6個普魯蘭多糖分子量標準品的高效凝膠色譜圖Fig.1　The high gel chromatography of six pullulan polysaccharides molecular weight standard

由圖1可以看出，每組混合樣品中，不同分子量普魯蘭多糖都能得到較好分離。按照Waters自帶的Breeze軟件進行標準曲線制作，如圖2所示，結果表明：普魯蘭多糖流出體積（mL）與log Mp線性關系很好，相關系數R2為99.83%。6個樣本積分計算結果如表2所示。

圖2　普魯蘭多糖分子量標準曲線Fig.2　The standard curve of pullulan molecular weight

表2　6個普魯蘭多糖標準品積分計算Table 2　The results of six samples integral calculation

結果表明：當不同分子量的普魯蘭多糖具有相同濃度時，積分面積的相對標準偏差為0.79%。因此，可以推斷峰面積只與普魯蘭多糖濃度有關，可能不受分子量的影響。

2.2　普魯蘭多糖含量標準曲線測定

5個不同濃度的普魯蘭多糖標準品混合溶液的色譜分離結果如圖3所示。

圖3　凝膠色譜標準曲線測定Fig.3　The standard curve of the gel permeation chromatogram

由圖3可以看出，峰面積大小與普魯蘭多糖含量存在一定的線性關系，通過Breeze軟件積分，結果如表3所示。

在0.2mg/mL～1.0mg/mL濃度范圍內，在同一濃度的條件下，普魯蘭多糖峰面積的相對標準偏差RSD%的范圍為0.64%～0.95%，遠遠小于1%，重復性好。將峰面積與含量進行線性擬合，結果如圖4所示。

表3　峰面積的統計結果從五濃度的pullulan標準Table 3　The statistical results of peak area from five concentrations of the pullulan standards

圖4　普魯蘭多糖含量的標準曲線Fig.4　The standard curve between peak areas and concentrations of pullulan

由圖4可以看出：峰面積與普魯蘭多糖含量之間符合正相關關系，相關系數R2為0.997 5。

2.3　穩定性、重復性和準確性的評估

使用2個已知濃度的普魯蘭多糖標準品進行方法穩定性和回收率試驗，按照上述試驗步驟進行處理，平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差（RSD%），測試結果見表4。

由表4可以看出，通過該方法，2個樣品分子量測試中，相對標準偏差（RSD%）分別為0.14%和0.13%，誤差率分別為0.04%和0.02%；而在含量的測試中，相對標準偏差（RSD%）分別為0.02%和0.01%，產品回收率分別達到99.7%和99.6%。

2.4　出芽短梗霉CGMCC No.11602發酵生產普魯蘭多糖過程中含量及分子量兩種測定比較

為了驗證新方法的可靠性，在本文中，同時采用了新方法和傳統方法，在出芽短梗霉CGMCC No.11602發酵生產普魯蘭多糖同時測定普魯蘭多糖含量和分子量。單因素方法分析被用來評價新方法和傳統方法測試結果的顯著性，結果如表5所示。

表4　目標物分子量和含量測試過程中相對標準偏差和回收率Table 4　The relative standard deviation and recovery rate of molecular weight and content

表5　出芽短梗霉CGMCC No.11602發酵生產普魯蘭多糖過程中發酵液中普魯蘭多糖含量及分子量Table 5　The pullulan content and molecular weight during the fermentation process of A.pullulans CGMCC No.11602

由表5可知：在發酵過程中4次測試中，新方法與傳統方法測試分子量的數據之間p值在0.143～0.334之間；新方法與傳統方法測試含量的數據之間p值在0.143～0.946之間，p值均大于0.05。因此，新方法和傳統方法測定結果之間無顯著性差異。

3　結論

普魯蘭多糖具有良好的生物相容性，具有特殊的聚合方式和線性連接結構。近年來，普魯蘭多糖在生物材料和生物醫學領域得到了廣泛的研究和應用，大大提高了普魯蘭多糖的附加值，但也對普魯蘭多糖的特性提出了更高的要求，特別是分子量和分子量分布。從理論上講，獲得不同分子量微生物多糖的方法包括有機溶劑沉淀分級、超濾、納米過濾、凝膠層析過濾級發酵調控等手段。

在發酵過程中，特別是后期發酵過程中，普魯蘭多糖的含量和分子量是不斷變化的。本文采用保護柱（UltrahyfrogelTM6×40 mm） 和凝膠柱（UltrahydrogelTMLinear 7.8×300 mm，Waters Chromatography，Inc），流動相 0.1mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫 30 ℃，示差折光檢測器（Waters 2424），利用分子量在9.6 kDa～2 350 kDa范圍內普魯蘭多糖標準品建立標準曲線，普魯蘭多糖流出體積（mL）與log Mp線性關系很好，相關系數R2為99.83%，在發酵過程中，將取樣離心去除菌體獲得的發酵液按照標準曲線測定的方法進行分子量測定，并與傳統的普魯蘭多糖分子量測定方法相比較（先獲得普魯蘭多糖粗品，然后再測定獲得分子量），新方法與傳統方法測試分子量的數據之間p值在0.143～0.334之間，新方法與傳統方法測試含量的數據之間p值在0.143～0.946之間，p值均大于0.05。因此，新方法和傳統方法測定結果之間無顯著性差異。

新方法幾乎實現了同步檢測發酵液中普魯蘭多糖的含量和分子量（檢測時間＜1 h），與此同時，該方法具有較好的準確性、精密度、重復性和穩定性。因此，本研究可以通過調節發酵過程，指導規模化發酵生產不同分子量的普魯蘭多糖，降低生產成本，拓展了普魯蘭多糖的應用范圍。

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