HPLC法測定動物肝臟中維生素A含量的不確定度評定

（南京旅游職業學院烹飪與營養學院，江蘇南京211100）

維生素A（vitamin A，VA）亦名視黃醇，是人體生長發育及維持機體生命活動所不可缺少的脂溶性維生素。維生素A不但可以維持正常的視覺功能防止夜盲癥，而且還具有維持上皮細胞結構的完整與健康、促進機體正常生長發育、增強機體的造血功能和預防癌癥等十分重要的功能[1-2]。動物肝臟被譽為食品中的“維生素A之王”。當前國內外動物肝臟中維生素A含量的測量多采用高效液相色譜方法來測定[3-6]。由于該方法在標準制備過程中步驟較為繁瑣，且每一處理步驟都會對測定結果的準確性帶來不同的影響。測量不確定度是表征合理的賦予被測量之值的分散性，是與測量結果相聯系的參數[7]。近年來隨著國際貿易的不斷發展，對檢測結果的國際互認提出了要求，為實現檢測結果的互認，測量不確定度得到了廣泛的應用[8]。

本試驗根據JJF 1135-2005《化學分析測量不確定度評定》[9]和JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[7]，并參考 JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[10]，結合檢測方法《GB 5009.82-2016食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定》[11]，對高效液相色譜測定動物肝臟中維生素A的含量進行不確定度評估，找出不確定度主要來源，以期為實驗室質量控制提供科學、準確的依據，同時為其他維生素含量的不確定度評定提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

為確保樣品的新鮮度，動物肝臟（鴨肝、豬肝和雞肝）均在每次試驗前臨時購于南京市玄武區鎖金村菜場。

1.2　儀器和試劑

1.2.1　主要儀器

U3000高效液相色譜儀：賽默飛公司；AB265-S分析天平（感量0.000 1 g）：梅特勒-托利多公司；超聲裝置：昆山市超聲儀器公司；RE-2000A旋轉蒸發儀：上海亞榮有限公司。

1.2.2　主要試劑

維生素A、甲醇：色譜純，阿拉丁試劑公司；乙醚、無水乙醇、正己烷、無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為純凈水：娃哈哈集團。

1.3　方法

1.3.1　樣品的處理

1）研磨：精確稱量5 g試樣，放入盛有15 g無水硫酸鈉的研缽中，研磨至試樣中水分完全被吸收，并均質化。

2）提取：小心地將全部均質化試樣移入帶蓋的三角瓶中，準確加入50 mL乙醚，壓緊蓋子，用力震蕩5 min，使試樣中維生素A溶于乙醚中，使其自行澄清。

3）濃縮：取澄清的乙醚提取液5 mL，放入比色管中，在80℃水浴上抽氣蒸干，立刻加入1 mL甲醇∶水=95∶5（體積比）溶解殘渣。

1.3.2　色譜條件

Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），甲醇 ∶水=95∶5（體積比），柱溫 30℃，流速：1.0 mL/min，檢測器波長：300 nm，進樣量：10 μL。

1.3.3　測量步驟

（1）標準溶液的配制：準確稱取維生素A乙酸酯10.0mg于250 mL皂化瓶中，加50 mL無水乙醇、20 mL 30%KOH甲醇溶液，于65℃回流皂化40 min，冷卻后用正己烷反復提取3次，并定容至10 mL容量瓶中，得濃度為1.0mg/mL的貯備液。（2）分別準確吸取相應體積的維生素A貯備液于10 mL容量瓶中，分別用甲醇 ∶水=95∶5（體積比）定容至10 mL，于300 nm測定其峰面積。以峰面積為縱坐標，維生素A含量為橫坐標繪制標準曲線圖。（3）樣品的測定：分別準確吸取0.5 mL樣品濃縮液，用甲醇∶水=95∶5（體積比）定容至10 mL。容量瓶中，于300 nm測定其峰面積。

1.4　數學模型

根據下列公式計算樣品中維生素A的含量。

計算公式：

式中：X為試樣中維生素A的含量，mg/100 g；c為由標準曲線上查得試樣中維生素A的含量，μg/mL；m為試樣質量，g；V為提取后加流動相：甲醇∶水=95∶5（體積比）定量之體積，mL；100為以每百克試樣計；20為樣品稀釋倍數。

1.5　不確定度來源分析

從測試全過程分析不確定度來源包括以下幾方面：重復測定引入的不確定度urel（1）；標準溶液配制的不確定度urel（2）；樣品測定過程產生的不確定度urel（3）；校準曲線擬合產生的不確定度urel（4）。

2　結果與分析

2.1　重復測定引入的不確定度urel（1）

樣品處理過程的一致性，采用平行測定10次的結果進行評定，屬于A類評定，按照試驗方法對樣品重復測定。重復測定的含量（X）、平均值、標準偏差S（X）、結果見表1，將結果分別代入公式其中n=10和計算得到重復測定引入的不確定度和相對不確定度。

表1　樣品中維生素A含量的測定結果Table 1　Determination of the content of vitamin A in the sample

2.2　標準溶液配制的不確定度urel（2）

標準溶液配制的不確定度來源于其純度P2、質量m2、體積 V2。

2.2.1　純度產生的不確定度

維生素A純品的含量為99%，按照矩形分布計算，其純度引起的不確定度為5.77×10-3。

2.2.2　稱量產生的不確定

本次試驗稱取10.0mg標準品，使用AB265-S分析天平稱量。根據儀器檢定證書，天平實際分度值為0.000 1，根據矩形分布計算，其標準不確定度為u（m2）==5.77×10-5，相對不確定度為urel（m2）==5.77×10-6。

2.2.3　體積產生的不確定度

容量瓶校準引入的不確定度：根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[10]，10 mL容量瓶（A）級容量允差為±0.02mL，按矩形分布，引入相對不確定度為：urel（V10-1）=1.15×10-3。溫度變化引起的不確定度：溫度變化引起液體體積變化明顯大于容量瓶體積的變化，故溫度變化帶來的不確定度可只考慮液體體積變化帶來的不確定度。已知甲醇的體積膨脹系數為1.2×10-3，測試溫度在（20±5）℃范圍內波動，按矩形分布計算標準不確定度為合成容量瓶體積量取引入的相對不確定度為urel（V10-2）=3.65×10-3。

移液管校準引入的不確定度：根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[10]，1 mL移液管（A）級容量允差為±0.007 mL，按矩形分布，引入相對不確定度為。溫度變化引起的不確定度：溫度變化引起液體體積變化明顯大于移液管體積的變化，故溫度變化帶來的不確定度可只考慮液體體積變化帶來的不確定度。已知甲醇的體積膨脹系數為 1.2×10-3，測試溫度在（20±5）℃范圍內波動，按矩形分布計算標準不確定度為3.46×10-3。合成移液管體積量取引入的相對不確定度為5.32×10-3。

合成體積體積產生的不確定度：urel（V2）=

綜合以上，標準溶液配制引入的不確定度為：

2.3　樣品測定過程中的不確定度urel（3）

樣品測定過程中的不確定度產生于樣品的稱量m3、樣品的定容V3和添加回收率R3的測定。

2.3.1　樣品稱量產生的不確定度

本次試驗稱取5 g動物肝臟樣品，使用AB265-S分析天平稱量。根據儀器檢定證書，天平實際分度值為0.000 1，根據矩形分布計算，其不確定度u（m3）==5.77×10-5，相對不確定度=1.15×10-5。

2.3.2　樣品定容產生的不確定度

樣品前處理需要1 mL移液管定容。根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[10]，1 mL 移液管（A）級容量允差為±0.007 mL，按矩形分布，引入相對不確定度為溫度變化引起的不確定度：溫度變化引起液體體積變化明顯大于移液管體積的變化，故溫度變化帶來的不確定度可只考慮液體體積變化帶來的不確定度。已知甲醇的體積膨脹系數為 1.2×10-3，測試溫度在（20±5）℃范圍內波動，按矩形分布計算標準不確定度為urel（V3-2）3.46×10-3。合成移液管體積量取引入的相對不確定度為5.32×10-3。

2.3.3　添加回收率產生的不確定度

本試驗采用方法的回收率對前處理引入的不確定度評定，對3種動物肝臟樣品進行高、中、低3個水平的加標回收率試驗，每個水平進行3次平行測定，測定回收率R、平均回收率標準偏差S（R）、結果見表2，將結果分別代入公式，其中n=9和，計算得到回收率引入的不確定度和相對不確定度。

表2　加標回收率試驗引入的不確定度Table 2　Uncertainty introduced by the test of recovery rate of adding standard

綜合以上，3種動物肝臟樣品測定過程中引入的不確定度，根據公式計算結果見表3。

表3　樣品測定引入的不確定度Table 3　Uncertainty introduced by sample determination

2.4　標準曲線擬合產生的的不確定度urel（4）

分別配制 0.2、0.4、1.0、2.0、5.0 μg/mL 的 5 種標準系列溶液，按照樣品處理步驟操作后上機，分別重復測定3次，通過Excel軟件得到相應的色譜峰面積Ai，擬合而成的線性回歸方程為Ai=aCi＋b，其中，a為斜率，b為截距，測定數據及計算結果如表4所示。分別取3種動物肝臟樣品，對維生素A濃度C0進行3次重復檢測，其結果見表5，則由標準曲線擬合產生的不確定度為

表4　維生素A標準曲線數據Table 4　Vitamin A standard curve data

表5　動物肝臟中維生素A含量的測定Table 5　Determination of vitamin A content in the liver of animals

p為對樣品中維生素A濃度C0的測定次數，p=3；C0見表3；n為測定次數，本次試驗中5個質量濃度重復測定3次，n=5×3=15；Ci為標準系列溶液的平均質量濃度

式中：

SA為標準溶液峰面積的標準偏差：

標準曲線擬合引入的不確定度urel（4），相關量值見表6。

表6　標準曲線擬合引入的不確定度Table 6　Uncertainty introduced by the standard curve fitting

2.5　合成不確定度

表7　樣品中維生素A的相對不確定分量及合成不確定度Table 7　Relative uncertainty component and synthetic uncertainty of vitamin A in the sample

2.6　擴展不確定度及測量結果

依據標準JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[7]，對大多數測量不確定評估，取置信水平95%，k=2，則本試驗中3種動物肝臟中維生素A含量擴展不確定度為U=urel（X）×X×2，由此得到高效液相色譜測定動物肝臟中維生素A含量的結果，見表8。

表8　不確定度評定結果Table 8　Evaluation result of uncertainty

3　結論

本試驗采用高效液相色譜法測定3種動物肝臟中維生素A含量，根據測量不確定度的評定方法，通過建立數學模型，分析整個測定過程中的不確定度來源及其對分析結果的影響，為高效液相色譜測定動物肝臟中維生素A含量評定方法提供參考。

從不確定度評定過程可以看出，影響動物肝臟中維生素A含量測定不確定度的主要來源有：重復測定引入的不確定度、標準溶液配制的不確定度、樣品測定過程產生的不確定度、校準曲線擬合產生的不確定度等，其中標準曲線擬合引入的不確定度最大，這與眾多類似的研究結果基本一致[12-15]。因此今后在使用HPLC測量動物肝臟中維生素A含量時，應根據不確定度分量加強準確測量，應注意以下幾點：（1）在實際操作過程中，可通過增加標準系列溶液的測定次數，增加平行樣品的測定；（2）減少樣品前處理過程引入的系統誤差，注意取樣的均勻性、代表型；（3）需要對分析天平進行定期的檢定與維護保養，以保持儀器的最佳工作狀態；（4）提高檢測人員的業務熟練水平，盡量減少測定結果的不確定度。從本試驗研究結果來看，不確定度評價可用于評估測量方法的可靠性，從而保證檢測結果的準確性。

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