HPLC法測定鐵皮石斛中酚酸類物質組成及含量

（廣東嶺南職業技術學院，廣東廣州510663）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬附生多年生草本植物，是傳統中草藥植物，具有生津養胃、滋陰清熱、降血糖、增強機體免疫力等功效，富含石斛多糖、生物堿、氨基酸、類黃酮、酚酸等對人體有益的天然藥物活性物質[1-2]。其中酚酸（Phenolic acids）是指結構中含有活潑氫供體的酚羥基有機酸[3-5]，主要為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，比如香草酸、丁香酸、沒食子酸、香豆酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸等。研究表明酚酸具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗紫外線輻射等功效[6-8]。因此進一步探明鐵皮石斛中對健康起促進功效的酚酸類物質組成及其含量具有重要意義。

目前酚酸的測定方法有毛細管電泳法[9]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、液相色譜-質譜聯用法（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[14-17]，研究對象主要為蔬菜[1]、水果[8]、水稻[10]等，但關于鐵皮石斛中酚酸類物質組成及其含量的報道較少。本研究針對10份不同產地的鐵皮石斛，采用甲醇超聲萃取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，Hypersil BDS C18色譜柱分離，二極管列陣檢測器測定，建立了高效液相色譜法同時測定13種酚酸類物質的檢測方法，該法簡便、高效、靈敏、準確，可為鐵皮石斛酚酸組成鑒定及質量研究提供技術支持。

1　材料與方法

1.1　儀器、試劑、材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；Rotavapor R-210旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；MM400型研磨儀：德國RETSCH公司；Milli-Q Integral型超純水機：美國Mill-pore公司；BRC-100A 30L型超聲波清洗器：鄭州渤銳超聲波設備有限公司；BS224S型電子天平：德國Sartorius公司。

13種酚酸標準物質：沒食子酸、原兒茶酸、N-p-香豆酰酪胺、松柏醇、二氫阿魏酰酪胺、丁香酸、丁香醛、香草酸、對羥基苯丙酸、對羥基桂皮酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、3-羥基肉桂酸（純度均大于98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，具體信息見表1。乙腈、甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；甲酸、乙酸銨（色譜純）：美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：上海安譜科學儀器有限公司；其余試劑均為分析純，試驗用水為超純水。酚酸標準儲備溶液：分別準確稱取適量的酚酸標準物質，用80%甲醇溶液配制成濃度為1 000 μg/mL標準儲備溶液，4℃保存。

表1　13種酚酸標準物質信息表Table 1　Information table of 13 kinds of phenolic acids

10份不同產地的鐵皮石斛，產地分別為安徽（大別山）、浙江（鄞縣、天臺、仙居）、福建（寧化）、廣西（天峨）、四川（合江）、云南（石屏、文山、麻栗坡），樣品經粉碎后，過200目篩，備用。

1.2　液相色譜條件

色譜柱：HypersilBDSC18（3.0μm，4.6mm×150mm）；流動相：10 mmol/L醋酸銨溶液（A）和甲醇溶液（B）；檢測波長：260、280、320 nm；柱溫：40℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；梯度洗脫條件見表2。

表2　洗脫梯度程序Table 2　The mobile phase gradient program of HPLC

1.3　樣品前處理

準確稱取2 g樣品（精度至0.1mg）于100 mL離心管中，加入20 mL 80%甲醇溶液（含有1%抗壞血酸），振蕩混勻后，室溫下超聲（300 W，40 KHz）提取30 min；加入10 mL 4mol/L NaOH溶液，充入N2后密封，37℃恒溫振蕩水解2 h（200 r/min）后，加入10 mol/L HCl調節pH至2。加入20 mL乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，35℃旋轉蒸發近干，用6 mL 80%甲醇溶液溶解后，Oasis HLB固相萃取柱凈化，凈化后經0.22 μm有機過濾頭過濾，濾液供液相色譜分析。

1.4　標準曲線繪制

分別移取1 000 μg/mL酚酸標準儲備溶液適量置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容，配制濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的酚酸混合標準工作溶液，自動進樣器進樣，測定峰面積，以酚酸標準溶液質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，建立線性回歸方程。

2　結果與討論

2.1　檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對13種酚酸類物質進行紫外線掃描（190 nm～700 nm），得到13種酚酸類物質的最大紫外吸收光波長。為了獲得較大的紫外吸收峰，并減少干擾，GA、PD、VA、HCA、HA 選擇 260 nm 作為檢測波長，紫外吸收較大，且干擾較小；TFT和HAD選擇280 nm作為檢測波長，紫外吸收較大，無雜峰干擾；PA、CA、SA、DH、HP、FA 選擇 320 nm 作為檢測波長。在260、280、320 nm 3種檢測波長下，13種酚酸類物質可獲得較好的色譜分離效果，紫外吸收較大、干擾小，且基線分離（圖1）。

2.2　色譜柱的選擇

考察了 poroshell 120 EC-C18、BEH C18、Penomenex C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C8等不同微粒填料的色譜柱對13種酚酸的分離效果（圖1）。

從圖1中可知：在260、280、320 nm 3種檢測波長下，13種酚酸在Hypersil BDS C18色譜柱上分離效果較好，峰形尖銳且對稱，故選擇Hypersil BDS C18作為分析色譜柱。

2.3　流動相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙酸銨-甲醇、磷酸二氫鉀-甲醇等流動相對13種酚酸色譜分離的影響。結果表明，以甲醇-水、乙腈-水和磷酸二氫鉀-甲醇作為流動相時，部分色譜峰拖尾，13種酚酸化合物的色譜峰不能實現有效分離，單個化合物出現雙峰；以乙酸銨-甲醇為流動相時，表現出較好的分離和洗脫能力，當乙酸銨濃度為10 mmol/L時，13種酚酸的色譜峰可得到較好的分離，基線平穩且色譜峰峰形尖銳對稱（圖1）。因此選擇乙酸銨-甲醇作為流動相。

圖1　13種酚酸標準液相色譜圖Fig.1　Chromatograms of 13 standard phenolic acid

2.4　萃取溶劑的選擇

考察了甲醇、乙腈、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷等有機溶劑對13種酚酸的萃取效果（圖2）。

從圖2可以看出：按13種酚酸平均萃取率高低順序排列為：乙酸乙酯（96.4%）＞甲醇（86.7%）＞二氯甲烷（79.3%）＞正己烷（71.5%）＞乙腈（68.1%）＞乙醇（63.4%），其中乙酸乙酯對13種酚酸的萃取率在88.4%～99.2%之間，平均值為96.4%。故選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

圖2　萃取溶劑對酚酸萃取效果的影響Fig.2　Effect of extraction solvent on the effect of phenolic acid extraction

2.5　凈化柱的選擇

考察了陰離子柱Oasis MAX、弱陰離子柱Oasis WAX、陽離子柱Oasis MCX、弱陽離子柱Oasis WCX、親水-親酯柱Oasis HLB等不同極性固相萃取柱對13種酚酸的凈化效果（圖3）。

圖3　固相萃取柱對酚酸凈化回收率的影響Fig.3　Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of phenolic acid extraction

從圖3中可知，親水-親酯柱Oasis HLB凈化回收效果較好，平均凈化回收率為94.6%，這可能是由于Oasis HLB屬于親水-親酯固相萃取柱，對各種極性、非極性物質都有均衡吸附作用。故選擇Oasis HLB作為固相萃取凈化柱。

2.6　基質效應

以鐵皮石斛空白提取液作為13種酚酸標準溶液的稀釋液，按照“1.4標準曲線繪制”配制一系列酚酸混合標準工作溶液，以酚酸標準溶液質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制鐵皮石斛基質標準曲線，將其斜率與空白基質的標準曲線斜率相比，斜率比值在84.7%～93.6%之間。這表明鐵皮石斛基質中部分酚酸存在略微的基質抑制效應。

2.7　線性范圍、相關系數、檢出限

在樣品中添加不同濃度的酚酸標準溶液，按“1.2液相色譜條件”進行測定，以酚酸標準溶液質量濃度為橫坐標（X，μg/mL），信號響度峰面積為縱坐標（A，mAu），建立標準曲線和線性回歸方程；以信噪比（S/N=3）計算方法檢出限（LOD），以信噪比（S/N=10）計算方法定量限（LOQ）（表3）。

表3　線性范圍、回歸方程、相關系數和檢出限（n=6）Table 3　Linear range，regression equations，correlation coefficients and limits of detection（n=6）

從表3中可知：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內，具有良好的線性關系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg之間；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之間。

2.8　回收率與精密度

分別在鐵皮石斛樣品中添加0.5、25.0、50.0 μg/mL 3種水平的酚酸混合標準溶液進行加標回收試驗，每個水平重復6次，加標回收率和相對標準偏差（RSD）結果見表4。

表4　加標回收率與精密度（n=6）Table 4　Recovery and precision（n=6）

續表4　加標回收率與精密度（n=6）Continue table 4　Recovery and precision（n=6）

由表4可知，13種酚酸的加標回收率在86.7%～102.3%之間，RSD在1.1%～3.5%之間，由此可見，該方法的準確度、精密度均能滿足方法學的要求。

2.9　實際樣品的檢測

將10份來自不同產地的鐵皮石斛樣品，按本文所建立的高效液相色譜法測定鐵皮石斛中13種酚酸類物質組成及其含量（表5）。

結果顯示：1）鐵皮石斛中共檢出12種酚酸，松柏醇未檢出，這也許說明鐵皮石斛中不含有松柏醇；所檢出的12種酚酸中，阿魏酸含量最高（含量在187.3mg/kg～423.7mg/kg 之間，平均值 293.9mg/kg），其次是丁香酸、二氫阿魏酰酪胺、對羥基苯甲酸，這些酚酸類物質可能與鐵皮石斛的抗氧化作用、增強免疫力、降血糖等功效有關，這為研究與開發鐵皮石斛活性物質提供參考。2）來源不同的10份鐵皮石斛樣品中，酚酸類成分和含量均存在差異，這種差異可能是由于品種、產地、采收季節、貯藏時間等差異引起的，但這種差異作為鐵皮石斛品種鑒定、真偽鑒別以及藥材品質綜合評價和開發利用提供科學數據。

表5　實際樣品中酚酸組成及其含量Table 5　Composition and content of phenolic acids in real samplesmg/kg

3　結論

針對10份不同產地的鐵皮石斛，采用甲醇超聲萃取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，Hypersil BDS C18色譜柱分離，二極管列陣檢測器測定，建立了高效液相色譜法同時測定13種酚酸類物質的檢測方法。結果表明：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內，具有良好的線性關系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg 之間；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之間；加標回收率在86.7%～102.3%之間，RSD在1.1%～3.5%之間；鐵皮石斛中共檢出12種酚酸，阿魏酸含量最高，其次是丁香酸、二氫阿魏酰酪胺、對羥基苯甲酸，這些酚酸可能與鐵皮石斛的抗氧化、增強免疫力、降血糖等功效有關，這將為鐵皮石斛活性物質研究與開發提供參考。

參考文獻：

[1]李娟,李順祥,黃丹,等.鐵皮石斛資源、化學成分及藥理作用研究進展[J].科技導報,2011,29(18):74-79

[2]李燕,王春蘭,王芳菲,等.鐵皮石斛中的酚酸類及二氫黃酮類成分[J].中國藥學雜志,2010,45(13):975-979

[3]喬麗萍,傅瑜,葉興乾,等.酚酸生物活性研究進展[J].中國食品學報,2013,13(10):144-152

[4]宋亞玲,王紅梅,倪付勇,等.金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究[J].中草藥,2015,46(4):490-495

[5]倪付勇,劉露,宋亞玲,等.金銀花中抗補體活性酚酸類成分的研究[J].中國中藥雜志,2015,40(2):269-274

[6]Choi K C,Son Y O,Hwang J M,et al.Antioxidant,anti-inflammatory and anti-septic potential of phenolic acids and flavonoid fractions isolated from Lolium multiflorum.[J].Pharmaceutical Biology,2017,55(1):611-619

[7]張翠,劉占云,於洪建,等.黑豆種皮的酚酸類成分研究[J].中草藥,2013,44(24):3440-3443

[8]劉麗金,周萍.核桃殼中酚酸的提取及含量測定[J].食品研究與開發,2017,38(20):55-60

[9]王蕎薇,謝媛媛,王義明,等.銀杏葉中銀杏酚酸類成分含量測定方法研究[J].中國藥學雜志,2015,50(2):167-173

[10]謝越,俞浩,汪建飛,等.高效液相色譜法同時測定滁菊樣品中的9種酚酸[J].分析化學,2013,41(3):383-388

[11]孫崇臻,王超,蔡子哲,等.高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸[J].食品科學,2013,34(10):281-285

[12]洪燕,韓燕全,夏倫祝,等.超高效液相色譜法同時測定不同產地蒼耳子9種酚酸類成分的含量[J].中國藥學雜志,2013,48(13):1109-1112

[13]張娜,王國祥,Abacar Jose Daniel,等.超高效液相色譜法分析稻米酚酸化合物組分及其含量[J].中國農業科學,2015,48(9):1718-1726

[14]Regnault-Roger C,Hadidane R,Biard J F,et al.High performance liquid and thin-layer chromatographic determination of phenolic acids in palm(Phoenix dactilifera)products[J].Food Chemistry,2017,25(1):61-71

[15]Lee J,Chan B L S,Mitchell A E.Identification/quantification of free and bound phenolic acids in peel and pulp of apples(Malus domestica)using high resolution mass spectrometry(HRMS)[J].Food Chemistry,2017,215:301-310

[16]Huang Y,Sun H Y,Qin X L,et al.A UPLC-MS/MS Method for Simultaneous Determination of Free and Total Forms of a Phenolic Acid and Two Flavonoids in Rat Plasma and Its Application to Comparative Pharmacokinetic Studies of Polygonum capitatum Extract in Rats[J].Molecules,2017,22(3):353-365

[17]Szewczyk K,Olech M.Optimization of extraction method for LC–MS based determination of phenolic acid profiles in different Impatiens,species[J].Phytochemistry Letters,2017,20(6):322-330