“代謝記憶”與糖尿病腎病

熊曉燕(綜述)　白壽軍(審校)

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院腎內科　上海　201700)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常見、最嚴重的慢性微血管并發癥,其主要組織病理學特征是腎小球肥大、系膜增生、腎小管細胞外基質積聚所致的間質纖維化、基底膜增厚、足細胞缺失和足突融合[1]。目前已成為西方國家終末期腎臟病(end stage renal disease ,ESRD)的首位病因,也是我國 ESRD 的主要病因,僅次于腎小球腎炎。DN的發生發展機制錯綜復雜,多數研究認為,DN的發病多與遺傳、糖化終末產物沉積、多元醇通路及蛋白質C激活、脂代謝異常、微循環障礙、氧化應激、炎癥因子、激肽釋放酶-激肽系統等有關。近年來的研究發現,表觀遺傳修飾異常[2]及足細胞自噬作用缺陷[3]在DN的發病及進展過程中也發揮著重要作用。約三分之一的糖尿病患者會發展為DN,使得DN的早期診斷和干預顯得至關重要[1]。

“代謝記憶”概述“代謝記憶”的概念源自于包括糖尿病控制與并發癥試驗(Diabetes Control and Complications Trial,DCCT)及糖尿病干預與并發癥流行病學(epidemiology of diabetes interventions and complications,EDIC)研究在內的一系列臨床試驗。DCCT試驗發現,早期強化血糖控制的1型糖尿病患者較標準化血糖控制的患者腎臟、神經系統等并發癥發生率及其嚴重程度明顯降低。隨后的EDIC 試驗中,兩組患者均使用強化治療,盡管兩組的HbA1c達到了相近水平,但之前在 DCCT中早期強化血糖控制的患者大血管及微血管并發癥風險明顯比未早期強化治療的患者高,由此最早提出了“代謝記憶”這一概念[4]。其他以2型糖尿病患者為對象的試驗亦發現,早期強化血糖控制在終止干預后仍能使患者長期獲益,這一現象稱之為“遺留效應”。“代謝記憶”現象在多種實驗模型中亦得到了證實。El-Osta等[5]利用短時間的高糖培養基培養內皮細胞,發現即使在轉為正常糖濃度培養后仍存在氧化應激持續激活和炎癥因子高表達。Intine等[6]用0.3%的鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)溶液成功構建出了斑馬魚糖尿病代謝記憶模型。“代謝記憶”現象的提出使我們對包括DN在內的糖尿病并發癥發生機制的認識有了突破性進展,大量的實驗室及臨床試驗表明,“代謝記憶”現象的產生可能與晚期糖基化終末產物(advanced glycation endoproducts,AGEs)及氧化應激所誘發的瀑布式效應、過氧化亞硝酸鹽的積累、表觀遺傳學修飾、慢性炎癥及細胞凋亡等有關[7]。

“代謝記憶”現象與DN機體對早期高血糖的“記憶”效應對DN的發生發展起重要作用,關于其具體機制的研究在近年來的報道中屢見不鮮,然而確切的作用機制還不甚清楚。越來越多的研究證據表明靶細胞表觀遺傳學改變是產生高糖“記憶”、導致DN的重要原因[8-9]。表觀遺傳學作為連接“代謝記憶”與DN的“紐帶”而備受關注。

表觀遺傳學修飾表觀遺傳學是遺傳學中的一個前沿領域,主要包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、微RNA、染色質重塑等[10]。高血糖刺激后,靶細胞炎性介質表達失調、活性氧簇類過度蓄積、蛋白質硝基化增加、AGEs 生成增多、凋亡相關基因持續高表達,大量研究表明,這些因素失調與表觀遺傳修飾密切相關、相輔相成。表觀遺傳學標記穩定且可代際相傳的特點,使得研究者們傾向于認為,表觀遺傳學變化可以為高糖“代謝記憶”提供分子機制方面的解釋[11]。

DNA甲基化可阻斷轉錄起始因子與啟動子的結合而抑制基因轉錄。眾所周知,足細胞為終末分化細胞,其結構和功能的完整性是維持正常腎功能的基礎。研究發現許多對維持足細胞及裂孔隔膜完整性有重要作用的蛋白均受表觀遺傳學調控[12]。例如足細胞表達的轉錄因子(kruppel-like factor 4,KLF-4)在高糖等應激條件下可誘導體細胞重新編程轉化為多能干細胞,從而發揮維持足細胞完整性作用,KLF-4因子與特定的反應元件結合時可導致nephrin啟動子區CpG二核苷酸去甲基化及H3K9乙酰化、波形蛋白啟動子區DNA甲基化,使nephrin蛋白表達增多,而波形蛋白表達減少。而研究發現在DN等一系列腎臟疾病狀態下,KLF-4表達減少,這使得科學家們思考是否可利用轉基因技術使KLF-4在足細胞中過表達以重建足細胞表型減少蛋白尿,Hayashi等[13]在多種動物模型中驗證了這一設想。

組蛋白翻譯后修飾包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP核糖化等[12],其中組蛋白甲基化及乙酰化在糖尿病“代謝記憶”和DN的進展中尤為重要。組蛋白轉錄后修飾可改變組蛋白與雙鏈DNA的親和力,從而改變染色質的疏松或致密狀態,調節基因表達[14]。目前的研究認為,DN的發生與腎臟組蛋白H3K9及 H3K23的乙酰化、H3K4二甲基化、H3第10位絲氨酸磷酸化有關,這些修飾可使染色質解螺旋,促進基因表達[15]。DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)、組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferases,HMTs)、組蛋白去甲基基酶(histone demethylases,HDMs)、組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyl-transferases,HATs)、組蛋白去乙酰基酶(histone deacethylases,HDACs)等是藥物開發的重要靶點。已有研究發現HDACs可使非組蛋白去乙酰化,HDAC4在人及嚙齒類動物DN模型中均升高,敲除HDAC4同工型可減弱糖尿病大鼠足細胞損傷、蛋白尿及細胞外基質沉積,進一步的研究發現HDAC4敲除可重建被高糖削弱的足細胞自噬。研究者推測,其可能的機制是轉錄因子STAT1的去乙酰化抑制了足細胞自噬[16]。Gao等[17]發現高糖處理的腎小球系膜細胞組蛋白H2A泛素化增加而H2B泛素化減少,組蛋白泛素化水平的改變可激活TGF-β信號通路導致腎損傷,泛素蛋白酶體抑制劑MG132可通過抑制組蛋白異常泛素化抑制TGF-β通路激活。

miRNA是一種由大約22個核苷酸組成的非編碼RNA,通過與特定的靶mRNAs 的3’-UTR結合來抑制基因表達,可參與維持細胞外基質動態平衡、保護足細胞功能。研究發現miRNA192、miRNA377、miRNA21和miRNA200家族等多種micro-RNA 與DN的發生有關。miRNA29c在db/db糖尿病小鼠腎小球系膜細胞中顯著上調,而敲除miRNA29c則蛋白尿及系膜基質沉積明顯減少[18]。最近的研究[19]顯示,miRNA218可通過直接下調血紅素加氧酶-1及促進p38-MAPK通路激活而加速高糖誘導的足細胞凋亡。miRNA125b、miRNA146a-5p及miRNA29a-3p的表達與NF-κB及p65等促炎基因的表達及持續性內皮功能損傷有關,是高糖“代謝記憶”的成因之一[20]。

以上這些機制并非完全獨立,DNA甲基化與組蛋白修飾可相互作用,而這兩者又可受miRNA的影響[21]。表觀遺傳學修飾既可使組織細胞或器官對環境刺激物迅速應答,又可在刺激物去除后使細胞產生“記憶”效應。

AGEsAGEs主要是由還原糖和蛋白質的氨基發生非酶促Maillard反應形成的穩定共價化物。AGEs的形成主要分3個步驟,其中最后一步為氧化、脫氫、環化反應。除血漿蛋白、脂蛋白等形成的AGEs外,大多數體內蛋白質形成的AGEs的半衰期都較長[22],可能是“代謝記憶”的成因之一。正常情況下,體內AGEs的產生與排出維持在一個較為平衡的狀態,但當生成過多如糖尿病、衰老、攝入AGEs過多或腎臟排出障礙等情況下,便會產生一系列病理生理改變。一方面,葡萄糖等糖類物質直接與蛋白質和脂質交聯,破壞蛋白甚至組織的結構和功能;另一方面,AGEs與其受體結合,激活一系列信號通路,增加炎癥因子等的表達,最終改變組織細胞的功能,甚至產生組織破壞[23]。此外,有研究發現AGEs可通過氧化應激反應可引起胰島β細胞合成及釋放胰島素功能障礙,誘導β細胞凋亡,還可抑制胰島β細胞發生自噬作用從而促進胰島β細胞凋亡[24]。AGEs可使腎小球系膜細胞發生非酶促糖化,導致腎小球高濾過。足細胞和腎小管細胞上表達的糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGEs)與AGEs作用后可通過促進活化氧類(reactive oxygen species,ROS)產生、減少內皮細胞NO產生等一系列反應導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化[25]。IV型膠原及層粘連蛋白糖化可導致血管對蛋白質的滲透性升高,一些細胞外基質蛋白糖化可使其被基質金屬蛋白酶的降解減少,導致基底膜增厚[26]。不論高血糖程度如何,AGE相關的細胞內線粒體呼吸鏈蛋白糖化可產生大量ROS,而ROS可通過非酶促糖化及糖氧化過程增加AGEs的生成,形成一個惡性循環放大AGE生成反應。這種瀑布式激活效應也是“代謝記憶”形成的重要原因[27]。

炎癥糖尿病患者腎臟、血管、視網膜等靶器官中吞噬細胞浸潤增加及炎癥基因表達增強,表明慢性炎癥是大多數血管并發癥的共同特征。Chan等[28]用高糖處理與視網膜分離的周細胞糖6個月后發現IL-1、TNF、ICAM-1、VEGF、TGF-β等表達上調,再重新建立良好的血糖水平并不能完全降低先前這些炎癥因子的上調及視網膜細胞的凋亡,說明周細胞對早期的高葡糖糖代謝產生了 “記憶”,炎癥因子參與了“代謝記憶”現象的形成。已有研究[29]證實,高糖調控炎癥基因表達增強主要與轉錄因子NF-κB通路激活有關,表觀遺傳學修飾參與了這一過程。NF-κB活化后誘導眾多因子的轉錄,包括細胞生長因子、趨化因子、黏附分子和NF-κB抑制蛋白等,其中許多因子可增強循環中單核細胞的作用,使外周血循環中的單核細胞在血管內皮下聚集,是DN等糖尿病血微管病變發生的重要機制之一。在單核細胞內,高糖處理可招募組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyl-transferases,HATs)如CBP/p300、p/CAF,進而促進炎癥基因啟動子區組蛋白H3賴氨酸乙酰化(H3Kac)、組蛋白H4賴氨酸乙酰化(H4Kac),導致染色質結構松散,促進基因轉錄[30]。在血管內皮細胞中,高糖主要通過招募組蛋白甲基轉移酶SET7,促進炎癥基因啟動子區組蛋白H3的賴氨酸4單甲基化(H3K4me1),增加炎癥基因及NF-κB活性亞基表達。

氧化應激及凋亡氧化系統與抗氧化系統失衡導致的氧化應激在DN的發生發展中起著關鍵性作用,高糖代謝產生的ROS是氧化應激導致組織損傷的中心環節[31]。線粒體是ROS產生的主要場所,高血糖時通過級聯放大效應使線粒體氧化呼吸鏈產生過多的ROS,比如超氧陰離子(O2-)等,O2-是H2O2、過氧亞硝基及其他強活性氧類的前體,產生過多可造成線粒體損傷,線粒體是細胞內ATP生成的主要場所,其功能失調是DN等糖尿病并發癥產生的重要原因。高糖刺激可促進線粒體被動力相關蛋白1(Drpl)和分裂蛋白(Fisl)切割為顆粒狀,使得線粒體內呼吸鏈活性增強,線粒體膜通透性增加,ROS產生增加。另外,高糖刺激可使Rho相關的卷曲蛋白激酶1(Rho-associated,coiled-coil-containing protein kinase 1,ROCK1)激活,使Drp1-Ser600磷酸化而導致線粒體分裂,ROS產生增加[32]。ROS介導多元醇通路、己糖胺途徑、RAGEs及其相關配體、蛋白激酶c等多個與DN相關的生物途徑激活,這些代謝異常又可進一步產生ROS。ROS可造成DNA鏈斷裂、堿基修飾、DNA-DNA交聯和DNA-蛋白質交聯等多種形式的DNA損傷,還可引起DNA甲基化狀態改變,在表觀遺傳水平引起基因轉錄激活或抑制[33]。線粒體介導的細胞氧化損傷是腎小管上皮細胞凋亡的主要原因之一。線粒體ROS可激活p38絲裂原蛋白激酶(p38MAPK)及TGF-AP,促進腎小管上皮細胞轉分化、間質細胞增生、細胞外基質聚集,最終導致腎纖維化。線粒體功能與內質網功能緊密相關,內質網應激亦是細胞損傷的重要原因。內質網是細胞內蛋白質合成折疊、鈣離子儲存、脂質合成的重要部位。正常情況下,內環境的穩定是內質網發揮正常功能的基本條件。在氧化應激導致蛋白質損傷時,可激活未折疊蛋白應答(unfolded protein response,UPR)以重建內質網穩態,而過度的UPR則可導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)使細胞功能失調并激活內質網跨膜蛋白肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)等促凋亡因子[34]。抗氧化應激藥物、Drp1及ROCK1基因敲除可抑制線粒體分裂,減少ROS產生,是延緩“代謝記憶”和DN進展的潛在靶點。此外,蛋白質C是內皮細胞表面的一種酶原,當其被凝血調節酶/凝血蛋白激活后可抑制血液凝固、調節細胞內信號,具有細胞保護功能。Isermann等[35]發現,依賴凝血調節蛋白激活的蛋白質C被破壞后,糖尿病小鼠足細胞凋亡增加、氧化應激加劇、蛋白尿增多。那么蛋白質C抗氧化應激、行使細胞保護功能的機制何在？這一問題引發了研究者們的進一步探索。Bock等[36]發現暴露于高糖濃度的足細胞氧化還原酶 p66Shc呈蛋白質C依賴型表達。p66Shc可從細胞色素c接受電子參與線粒體氧化應激。他們進一步研究發現p66Shc高表達與其啟動子區CpG二核苷酸過度甲基化及組蛋白H3高度乙酰化有關。這些研究不僅為氧化應激參與糖尿病足細胞損傷提供了有力證據,同時也證明氧化應激與表觀遺傳調控密切相關,為抗氧化應激治療DN提供了實驗依據。

結語“代謝記憶”與DN并不是簡單的因果關系或平行關系,產生“代謝記憶”現象的內在機制是包括DN在內的一系列糖尿病并發癥的基礎。這些機制主要包括表觀遺傳學修飾、糖化終末產物、氧化應激、炎癥等,各因素間相互作用造成糖尿病并發癥發生發展(圖1)。對于DN等糖尿病相關并發癥除了早期強化血糖控制,減弱高糖“代謝記憶”效應外,還應針對以上機制選擇合理有效的治療方案。由于表觀遺傳學可在基因轉錄水平對各種疾病相關因子進行調控,因而成為近年來的研究熱點。與經典遺傳學不同的是,表觀遺傳信息主要決定組織細胞的功能狀態,其調控作用的可逆性為表觀遺傳藥物應用于臨床提供了理論依據,目前已有針對腫瘤DNA異常甲基化及組蛋白異常修飾的表觀遺傳學藥物批準上市。表觀遺傳及“代謝記憶”機制研究的不斷深入將為DN的早期診斷及延緩腎功能惡化打下堅實基礎。

圖1　高糖“記憶”與糖尿病發生發展的關系Fig 1　The relationship between hyperglycemic memory and diabetic nephropathy

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