激素和光照對青蒿素合成途徑酶基因表達的調控研究

于宗霞

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

青蒿素是一種含有內過氧橋的倍半萜內酯，是治療瘧疾的有效成分，需求量極大[1]。目前，通過化學全合成、合成生物學進行青蒿素的體外合成，步驟復雜、成本較高，距離產業化和臨床應用還有一定距離。野生青蒿(黃花蒿)仍是青蒿素的唯一來源，但植株中青蒿素含量低，僅占干重的0.1%～0.8%[2]。因此，通過基因工程手段提高植株中青蒿素含量具有重要意義。

青蒿素生物合成途徑已經基本清晰：首先，法尼基焦磷酸（FDP）被紫穗槐－4,11－二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）催化環化生成紫穗槐－4,11－二烯[3]；接著，細胞色素P450單加氧酶CYP71AV1，催化紫穗槐二烯依次形成青蒿醇、青蒿醛，最終得到青蒿酸[4]。一個雙鍵還原酶，DBR2，催化青蒿醛的△11,13位生成二氫青蒿醛[5]；青蒿醛、二氫青蒿醛進一步被乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase ALDH）氧化成青蒿酸、二氫青蒿酸。但后續如何生成青蒿素尚無明確報道，推測可能是通過非酶促光氧化反應。該途徑大部分的酶定位于青蒿腺毛的兩個頂端細胞中，推測青蒿素在這些細胞中起始合成[6]。

相比于青蒿素合成途徑解析以及微生物代謝工程改造方面取得的成績[7,8]，青蒿素內源合成調控方面的報道還很少。青蒿素作為植物長期適應環境產生的一種次生代謝產物，其合成首先受到各種環境因子的影響，體外施加各種激素或者光處理，可以模擬植物生存環境的變化，激活體內相應信號途徑的轉錄因子，調控青蒿素的合成。如水楊酸和茉莉酸可以激活下游的AaWRKY和AaERF等轉錄因子，進而調控青蒿素合成途徑關鍵酶基因ADS和CYP71AV1的表達水平，最終促進青蒿素的合成[9,10]，藍光受體AtCRY1可以響應光信號，從而影響青蒿素合成[11]。植物激素除了響應外界生長環境，還與植物的生長發育密不可分，赤霉素（GA）促進種子萌發，生長和開花，而脫落酸（ABA）則抑制這些生長發育過程[12]，植物細胞的全能性和再生能力受到細胞分裂素(CTK)和生長素(auxin)的共同調控[13]，茉莉酸（JA）促進雄蕊的正常發育[14]，乙烯（ETH）在促進光形態建成和植物的成熟衰老過程中發揮重要作用[15]。

青蒿素需求量大，價格昂貴(USD300～600/kg)，但青蒿中青蒿素含量極低。最近的臨床研究表明，食用干燥的青蒿葉片比服用單體青蒿素的藥效高40倍，健康人群飲用青蒿茶可以預防瘧疾[16]，暗示青蒿中其他次生代謝產物有增強青蒿素活性和藥效的功能。因此通過研究激素和光照對青蒿素合成的影響，在采收之前可以通過添加適當的激素或光照，從而提高青蒿素的產量，具有重要的經濟價值和藥用價值。

1 材料與方法

1.1 材料：

青蒿（Artemisia annua L.）野生栽培品系QT源自四川省；M-MLV反轉錄試劑盒（Invitrogen）；SYBR? Premix Ex TaqTM.（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa）；脫氧核苷酸引物（Sangon，上海）。

1.2 方法：

1.2.1 植物RNA提取

取0.1 g植物材料于液氮中充分成細粉。移入1.5 mL離心管中，加入0.5 mL Trizol（Invitrogen，Cat.15596-018）混勻，室溫放置5 min；加入100 μL三氯甲烷充分混勻后1200 0rpm冷凍離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇沉淀RNA。12000 rpm冷凍離心10 min，沉淀用75%酒精洗滌，真空干燥，溶于 20～50 μL H2O (RNase free)。

1.2.2 RNA反轉錄及定量分析

取1 g植物總RNA為模板依據M-MLV反轉錄試劑盒（Invitrogen）說明進行反轉錄。反轉錄產物稀釋10倍后作為定量分析的模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），使用表1中的引物對不同基因的表達量進行Q-RT PCR檢測。反轉錄產物進行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀釋度）制作標準曲線。以青蒿的AaACTIN（EU531837）作為內標參考，基因（X）表達量以X/Actin2表示。數據分析采用Rotor-Gene（Corbett Research，NSW，Australia）。實驗重復三次，取各組數據的平均值和方差，繪制圖表。

1.2.3 引物設計

用于Q-RT PCR檢測的青蒿素合成途徑酶基因ADS（AJ 25171），CYP7（EU684540），DBR2（EU704257）和內參基因AaACTIN的引物序列如表1所示。

表1 Q-RT PCR使用的基因引物序列

2 結果與分析

2.1 青蒿素合成途徑酶基因表達的組織特異性

有報道青蒿素含量在開花之前達到頂峰，暗示青蒿素的合成在花期最為旺盛。選取青蒿的不同組織，如花（F）、嫩葉（NL）、老葉（OL）、莖（S）和根（R），分別在這5組植物樣本中檢測青蒿素合成途徑酶基因的表達水平，ADS、CYP71AV1和DBR2這三個酶基因在花序中均有較高水平的表達（圖1），與青蒿素含量在開花之前最高的報道吻合，說明青蒿素的合成具有時空特異性，與青蒿素的生長階段密切相關，即生殖生長階段含量豐富。

圖1 青蒿素合成途徑酶基因的組織表達特異性

2.2 激素對青蒿素合成的影響

青蒿素是青蒿在長期進化過程中適應環境產生的一種次生代謝產物，它的合成會受到外界環境影響。在實驗室中通過激素以及不同波長的光照來模擬外界環境的變化，通過該研究，可以在高產轉基因青蒿植株采收之前，對植物進行大批量的施加激素或者光照處理，從而達到進一步提高青蒿素含量的目的。

圖2 激素SA、MeJA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達水平

圖3 激素ABA、GA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達水平

圖4 不同濃度激素IAA處理后青蒿素合成途徑酶基因表達水平。IAA-1到IAA-4依次代表IAA處理濃度為0.03、0.3、3和 30μM。

SA和MeJA處理青蒿后，檢測基因表達可見MeJA處理后，ADS、CYP71AV1和DBR2的轉錄水平均有明顯提高，其中ADS的表達水平受MeJA誘導顯著，SA處理后，僅ADS和CYP71AV1的轉錄水平提高，DBR2無明顯變化（圖2）。后續分別用50M的赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）（圖3）以及不同濃度的生長素（IAA，低濃度促進生長，高濃度抑制生長）（圖4）進行處理，操作方法同SA和MeJA的處理。選取葉片進行實時定量PCR檢測，結果表明不同激素對青蒿素合成途徑酶基因的表達水平都有一定的影響，其中ABA和特定濃度的生長素的誘導效果要明顯一些。

2.3 光照對青蒿素合成的影響

植物次生代謝產物的合成還會受到光照的影響，如光的波長和光強等，在現有實驗條件下，分別將長勢類似的1個月大的青蒿小苗放在正常光照、暗室和紅光下（640±20 nm，15 umol·m-2·s-1）處理8小時后，選取葉片進行基因表達水平檢測。結果表明：暗處理抑制青蒿素合成途徑酶基因的表達，紅光則會誘導其表達（圖5）。

圖5 青蒿素合成途徑酶基因對光處理的響應

3 討論

從青蒿素合成途徑酶基因的組織表達特異性可見，基因的表達水平在花序中較高，與青蒿素合成在開花之前達到最高的報道吻合，說明青蒿素的合成具有時空特異性，青蒿素的合成與植物生長階段相關，即在生殖生長時期合成旺盛，暗示青蒿素的合成可能受到年齡因子的調控。

此外，青蒿素作為一種次生代謝產物，其合成還受到環境因子的影響，我們通過施加激素和不同波長的光照來模擬環境的變化，MeJA、ABA、一定濃度的IAA和紅光都會提高青蒿素合成途徑酶基因的表達水平。激素除了作為環境因子的響應信號途徑外，也參與了植物生長發育的整個過程，從這個層面上說，環境和年齡是兩個不可分割的因子，共同影響了青蒿素的合成。本研究主要從激素和光照角度闡釋環境對青蒿素合成的影響，從而為找出誘導青蒿素合成的方法打下基礎，可以于青蒿采收之前施加，達到短期進一步提高青蒿素產量的目的。