弓形蟲多態(tài)性ROP16效應(yīng)分子誘導(dǎo)宿主A549細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異研究

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弓形蟲是一種可引起人獸共患病的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，該病呈世界性分布，全球約有1/3的人感染弓形蟲[1]。孕婦感染后可發(fā)生垂直傳播，導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常、畸形、死胎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，85%感染成活的嬰兒會出現(xiàn)中樞系統(tǒng)異常，極大地影響優(yōu)生優(yōu)育。另外，弓形蟲也是導(dǎo)致免疫功能損傷或缺陷病人死亡的重要原因之一[2-3]。

弓形蟲主要有3種典型基因型，即Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型。盡管3種基因型蟲株的遺傳同源性高達(dá)98%，但毒力卻相差懸殊。其中，Ι型弓形蟲(RH株)毒性最強(qiáng)，Ⅱ型(Me49株)和Ⅲ型(VEG株)毒性較弱[4]。弓形蟲的毒力主要表現(xiàn)為對宿主細(xì)胞的侵襲力、在胞內(nèi)的增殖速率，能否在胞內(nèi)形成包囊及對宿主的致病性和致死性等。弓形蟲棒狀體蛋白16(ROP16)是一種蛋白激酶，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮了極其重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ROP16是重要的毒力調(diào)節(jié)因子，它主要定位于宿主細(xì)胞核內(nèi)[6-7]，不同弓形蟲株間的ROP16基因序列呈多態(tài)性，可調(diào)節(jié)不同蟲株感染的宿主細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。因此，研究不同基因型ROPl6對宿主基因表達(dá)譜的影響，對弓形蟲的防治具有重要意義。本研究以A549細(xì)胞株為研究模型，建立了弓形蟲Ι、Ⅱ和Ⅲ型ROP16穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，并對差異基因進(jìn)行GO分析和信號通路富集分析(pathway analysis)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑弓形蟲RH、Me49株由本實(shí)驗(yàn)室保存；ICR小鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心；Trizol(Invitrogen公司，美國)；質(zhì)粒小提試劑盒；2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司，北京)；Real time PCR 試劑盒(寶生物，大連)；第一鏈cDNA合成試劑盒(全式金生物科技有限公司，北京)；TransLipid Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑(全式金生物科技有限公司，北京)；EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司，美國)；T4 DNA連接酶(北京全式金科技有限公司，北京)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)；E.coliDH5α，A549細(xì)胞，pEGFP-N1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。全基因組表達(dá)譜芯片采用Agilent人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片；引物合成和質(zhì)粒測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2方法

1.2.1弓形蟲RH/Me49株RNA的提取與cDNA的合成弓形蟲RH株采用小鼠腹腔接種傳代的方法[8]。RH復(fù)蘇后，腹腔接種小鼠。約5～7 d，小鼠出現(xiàn)背毛逆立、腹部膨大等癥狀時(shí)，PBS沖洗腹腔，收集腹水。傳代3次后，弓形蟲活力基本穩(wěn)定。折頸處死小鼠，抽取腹腔液，800 g離心去掉細(xì)胞沉淀，PBS沖懸后2 000 g離心，收集沉淀即為弓形蟲。Me49株則采用HFF細(xì)胞培養(yǎng)體系，即培養(yǎng)好的HFF細(xì)胞中加入Me49蟲株，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)一周后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，800 g離心去掉細(xì)胞碎片，隨后12 000 g離心，收集沉淀即為弓形蟲。按照Trizol說明書，對沉淀進(jìn)行總RNA的提取，提取的RNA經(jīng)過濃度及純度檢測，-80 ℃保存。按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄，即可得到弓形蟲RH/Me49株cDNA 模板。

1.2.2弓形蟲ROP16引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上公布的序列，對弓形蟲RH株ROP16基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物兩端同時(shí)包含EcoRⅠ，SalⅠ酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基，上游序列：5′-CCGGAATTCTGATGAAAGTGACCACGAAAGGG-3′，下游序列：5′-ACGGTCGACCATCCGATGTGAAGAAAGTTC-3′。弓形蟲Me49株ROP16基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物時(shí)，上游引物仍然選用EcoRⅠ，故上游序列繼續(xù)采用RH株上游引物。下游引物選用KpnⅠ酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基，下游序列：5′-CGGGTACCACATCCGATGTGAAGAAAGTTC-3′。引物的設(shè)計(jì)要使其PCR產(chǎn)物能夠與pEGFP-N1質(zhì)粒連接，同時(shí)3′端去掉終止密碼子，以不影響載體熒光蛋白的表達(dá)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3ROP16重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定建立40 μL PCR反應(yīng)體系，2×PCR Mix 20 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 16 μL，退火溫度為55 ℃。將PTEN PCR產(chǎn)物與pEGFP-N1載體質(zhì)粒分別應(yīng)用EcoRⅠ和SalⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，DNA凝膠回收試劑盒分別回收，將回收后的PCR酶切產(chǎn)物與pEGFP-N1質(zhì)粒按5∶1比例混合，采用T4連接酶進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為22 ℃，1 h；轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃ Kan抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定并測序。取測序正確后的菌液，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.2.4VEG蟲株ROP16重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定VEG蟲株ROP16采用基因全合成的方式進(jìn)行，參照ToxoplasmagondiiVEG ROP16 基因 CDS 序列，序列全長2 124 bp，去掉3′端終止密碼子“TAG”，在兩端分別加入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，70 ℃退火形成雙鏈，將其連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行陽性克隆篩選，最后陽性質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切和測序雙重鑒定。

1.2.5ROP16 mRNA的表達(dá)與鑒定接種A549細(xì)胞過夜，待長滿到90%時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后每24 h更換新鮮10% FBS-DMEM培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，提取pEGFP-N1-ROP16、pEGFP-N1及空A549細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用特異性擴(kuò)增ROP16的引物(Forward：5′-CGGCTGAAGTAGGTCTCGG-3′；Reverse：5′-GGTGAAAGCTGGGTTTGGT-3′，160 bp)，以β-actin(Forward：5′-CACTGTGCCCATCTACGA-3′；Reverse：5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′，155 bp)作為內(nèi)參進(jìn)行Real-Time PCR(PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃)，檢測得到的數(shù)據(jù)根據(jù)2-△△Ct方法分析各組A549細(xì)胞中ROP16的mRNA表達(dá)水平。

1.2.6表達(dá)譜芯片以及數(shù)據(jù)分析采用Trizol試劑提取RNA，NanoDrop ND-1000評估RNA量和質(zhì)量。RNA完整性通過標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳進(jìn)行評估。表達(dá)譜芯片采用Agilent人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片，樣品標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案執(zhí)行。使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1) 獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)軟件計(jì)算基因表達(dá)差異。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為絕對倍數(shù)變化(absolute foldchange)在2.0 倍以上。采用Cluster 3.0 軟件對基因進(jìn)行聚類分析。本實(shí)驗(yàn)由上海康成生物有限公司完成。

1.2.7生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用MAS 3.0系統(tǒng)和KEGG數(shù)據(jù)庫分別對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分析和信號通路分析。SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1pEGFP-N1-RH/M49/VEG ROP16轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后mRNA水平本研究將RH/M49/VEG ROP16基因連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，而后將質(zhì)粒pEGFP-N1-RH ROP16、pEGFP-N1-ME49 ROP16及pEGFP-N1-VEG ROP16 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。圖1 為RT-PCR檢測各組ROP16在A549細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)pEGFP-N1-RH/M49/VEG ROP16轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，mRNA的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組與pEGFP-N1組明顯上調(diào)(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組較pEGFP-N1組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1　弓形蟲ROPl6 基因的mRNA表達(dá)Fig.1　RT-PCR analysis of the ROPl6 mRNA of T.gondii

2.2差異基因的表達(dá)及分布情況采用Agilent人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片進(jìn)行差異基因篩選，其涵蓋27 958個(gè)Entrez基因RNAs。結(jié)果如圖2所示，紅色為表達(dá)上調(diào)，綠色為表達(dá)下調(diào)。pEGFP-N1-RH ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 776個(gè)，下調(diào)miRNA 494個(gè)；pEGFP-N1-VEG ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 842個(gè)，下調(diào)miRNA 520個(gè)；pEGFP-N1-Me49 ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 5 063個(gè)，下調(diào)miRNA 5 989個(gè)。分別將這3組進(jìn)行對比后顯示：pEGFP-N1-RH ROP16：pEGFP-N1-VEG ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 145個(gè)，下調(diào)miRNA 234個(gè)；pEGFP-N1-Me49 ROP16：pEGFP-N1-RH ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 4 093個(gè)，下調(diào)miRNA 5 598個(gè)；pEGFP-N1-Me49 ROP16：pEGFP-N1-VEG ROP16轉(zhuǎn)染組上調(diào)miRNA 4 173個(gè)，下調(diào)miRNA 5 523個(gè)。與弓形蟲RH和VEG株相比，Me49蟲株介導(dǎo)了更多和弓形蟲有關(guān)的差異基因變化，其致病機(jī)制與RH和VEG蟲株所不同。

A.pEGFP-N1-RH ROP16; B.pEGFP-N1-VEG ROP16; C.pEGFP-N1-Me49 ROP16; D.pEGFP-N1-RH ROP16: pEGFP-N1-VEG ROP16; E.pEGFP-N1-Me49 ROP16: pEGFP-N1-RH ROP16; F.pEGFP-N1-Me49 ROP16: pEGFP-N1-VEG ROP16.圖2　散點(diǎn)圖，紅色和綠色標(biāo)記的數(shù)據(jù)點(diǎn)分別表示各組倍數(shù)變化(fold change)≥2.0和≤-2.0的基因，黑色標(biāo)記表示倍數(shù)變化-1.9～1.9的基因，為表達(dá)基本無差異的基因Fig.2　Scatter diagram.The red and green points respectively represent the genes which has a fold change≥2.0 or≤-2.0.And the black points represent the genes that has a -1.9 to 1.9 fold change,which means no difference

2.3差異表達(dá)基因的聚類分析差異基因經(jīng)聚類分析顯示(圖3)，pEGFP-N1-RH ROP16轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1-VEG ROP16轉(zhuǎn)染組基因表達(dá)譜相似，相對比于未轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1組都無顯著變化。而pEGFP-N1-Me49 ROP16轉(zhuǎn)染組同pEGFP-N1-RH ROP16和pEGFP-N1-VEG ROP16轉(zhuǎn)染組在總體的基因表達(dá)譜上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。更進(jìn)一步說明弓形蟲Me49同RH和VEG蟲株的致病機(jī)制不同，而RH和VEG蟲株致病機(jī)制相似。

2.4差異表達(dá)基因的Pathway途徑分析通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，同pEGFP-N1相比較，pEGFP-N1-ME49 ROP16信號通路發(fā)生改變的共有74條，其中與pEGFP-N1-ME49 ROP16 VS pEGFP-N1-RH ROP16，pEGFP-N1-ME49 ROP16 VS pEGFP-N1-VEG ROP16重合的信號通路有55條，而pEGFP-N1-Me49 ROP16單獨(dú)調(diào)控的信號通路共有19條，如表1所示。顯示，pEGFP-N1-Me49 ROP16單獨(dú)調(diào)控的信號通路主要與NF-κB、Toll樣受體，趨化因子等信號通路、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)和代謝相關(guān)。

圖3　聚類分析圖Fig.3　Cluster trend diagram

表1pEGFP-N1-ME49 ROP16單獨(dú)調(diào)控的信號通路
Tab.1Pathway analysis of differently expressed genes solely dominated by pEGFP-N1-ME49 ROP16

SignalpathwayGeneNo．IntestinalimmunenetworkforIgAproduction?Homosapiens(human)14Reninsecretion?Homosapiens(human)16Leukocytetransendothelialmigration?Homosapiens(human)26Measles?Homosapiens(human)31HepatitisB?Homosapiens(human)30RIG?I?likereceptorsignalingpathway?Homosapiens(human)17InfluenzaA?Homosapiens(human)34Rheumatoidarthritis?Homosapiens(human)20Africantrypanosomiasis?Homosapiens(human)10Toll?likereceptorsignalingpathway?Homosapiens(human)22Herpessimplexinfection?Homosapiens(human)34Chemokinesignalingpathway?Homosapiens(human)34Antigenprocessingandpresentation?Homosapiens(human)16Malaria?Homosapiens(human)11Estrogensignalingpathway?Homosapiens(human)19Oxytocinsignalingpathway?Homosapiens(human)28Serotonergicsynapse?Homosapiens(human)21NF?kappaBsignalingpathway?Homosapiens(human)18Osteoclastdifferentiation?Homosapiens(human)24

3　討　論

目前認(rèn)為全球分布的弓形蟲分離株基因型可以分為4種類型，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型以及非典型 。盡管非典型弓形蟲包含100多種基因型，但90%以上的分離株也還是屬于基因型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的雜交[9]。研究發(fā)現(xiàn)，3種基因型蟲株最本質(zhì)的區(qū)別在于毒力。以RH蟲株為代表的Ⅰ型弓形蟲大都是強(qiáng)毒株。雖然Ⅰ型蟲株并不引起大范圍的流行，但卻與人先天性弓形蟲病密切相關(guān)[10]。小鼠模型中，該基因型蟲株毒性極大，對小鼠的絕對致死量是1個(gè)速殖子，感染小鼠多在急性期死亡且會造成高度蟲血癥，導(dǎo)致弓形蟲經(jīng)胎盤傳播的概率增大。Ⅱ型和Ⅲ型蟲株的毒力較弱，對小鼠的半數(shù)致死量是102～105個(gè)速殖子，且呈隱性感染。人弓形蟲病的發(fā)生主要與Ⅱ型蟲株有關(guān)，其占艾滋病患者感染的65%。Ⅱ型蟲株易從速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子和形成包囊(如Me49和PRU株)，歐美人體感染多為此型。Ⅲ型蟲株(如VEG和CTG株)毒力較Ⅱ型弱，在動物體內(nèi)的出現(xiàn)頻率要高于人體[10-14]。

弓形蟲強(qiáng)弱毒株的差異與感染宿主細(xì)胞后不同蟲株分泌出的蛋白質(zhì)和效應(yīng)因子的多態(tài)性有關(guān)，導(dǎo)致差異性的宿主細(xì)胞信號通路的激活。大量研究表明，棒狀體蛋白激酶ROP16、ROP18、ROP5和致密顆粒蛋白GRA15都是弓形蟲毒力決定因子。其中，ROP16非常特殊，其特異性定位于人體細(xì)胞核內(nèi)[6-7]，具有蛋白激酶活性，主要通過磷酸化宿主細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3和STAT6而發(fā)揮功能[15-17]。

Saeij等利用遺傳學(xué)方法結(jié)合數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)定位(QTL)掃描分析發(fā)現(xiàn)，ROPl6基因序列呈多態(tài)性，Ⅱ型與Ⅰ、Ⅲ型弓形蟲基因序列同源性存在差異[18]。本研究結(jié)果與之類似，與對照組相比較，ROP16I介導(dǎo)了1 270個(gè)表達(dá)差異顯著基因；ROP16III介導(dǎo)了1 362個(gè)表達(dá)差異顯著基因；而ROP16II卻介導(dǎo)了更多差異基因變化，共11 052個(gè)，這些基因主要與細(xì)胞組成有關(guān)，參與分子結(jié)合、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程等，多數(shù)基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝以及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。隨后，對差異基因進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，ROP16I/III轉(zhuǎn)染組基因表達(dá)譜相似。而ROP16II轉(zhuǎn)染組同ROP16I/III轉(zhuǎn)染組基因表達(dá)譜差異顯著。

大量研究表明，Ⅰ、Ⅲ型弓形蟲ROP16都是絲/蘇氨酸激酶，同時(shí)還具有酪氨酸激酶活性。在弓形蟲主動侵入宿主細(xì)胞時(shí)，ROP16由棒狀體釋放進(jìn)入胞質(zhì)，然后迅速進(jìn)入宿主細(xì)胞核對STAT3的705位酪氨酸和STAT6的641位酪氨酸進(jìn)行磷酸化，促使巨噬細(xì)胞向M2極化，并且抑制了IL-12的產(chǎn)生及NF-κB的轉(zhuǎn)錄，使得免疫應(yīng)答偏向Th2途徑。雖然減輕了免疫病理損傷，但是免疫功能受到抑制，易產(chǎn)生重度急性感染；另外，促進(jìn)Arginase-1和M2相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有助于蟲體的大量增殖。相反，Ⅱ型蟲株的ROP16則無此功能，主要因?yàn)槠銻OP16存在多態(tài)性導(dǎo)致功能缺失，例如ME49蟲株ROP16因在503位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸多態(tài)性改變(由亮氨酸變?yōu)榻z氨酸)，而無法有效活化STAT3。但Ⅱ型弓形蟲的致密顆粒蛋白GRA15可通過不依賴MyD88途徑直接磷酸化NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞極化為M1型。M1高表達(dá)iNOS、NO、IL-12和IL-1β等炎性因子，并可誘導(dǎo)NK、Th1和Th17 活化，表達(dá)高水平的IFN-γ、IL-17、IL-22 和IL-10等，啟動M1/Th1優(yōu)勢應(yīng)答殺傷蟲體，以控制和清除弓形蟲的感染[19-24]。另外，我們對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway途徑分析發(fā)現(xiàn)，同ROP16I/III相對比，ROP16II單獨(dú)調(diào)控的信號通路有19條。主要與NF-κB、Toll樣受體，趨化因子等信號通路、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)和整體代謝相關(guān)通路相關(guān)。Ⅱ型弓形蟲是導(dǎo)致人弓形蟲病的主要蟲株，了解其單獨(dú)調(diào)控的信號通路對于Ⅱ型弓形蟲的防治具有重要意義。

綜上所述，不同基因型弓形蟲棒狀體蛋白ROP16的多態(tài)性對宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答至關(guān)重要，免疫應(yīng)答的類型不僅直接影響機(jī)體的免疫功能，而且與弓形蟲病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。雖然現(xiàn)在對于弓形蟲不同基因型蟲株的毒力差異分子機(jī)制有了一些進(jìn)展，但是對不同基因型弓形蟲侵入宿主細(xì)胞過程的作用機(jī)理和致病機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

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