熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸診斷肺結(jié)核的價(jià)值

吳淑紅 榮福 歐陽(yáng)雁弟

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸（TbDNA）診斷肺結(jié)核的臨床價(jià)值。方法 選取51例肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組， 另選60例非肺結(jié)核患者作為對(duì)照組。所有患者均完善BALF TbDNA檢測(cè)及毛刷涂片抗酸染色鏡檢、痰涂片抗酸染色鏡檢。以評(píng)價(jià)BALF中TbDNA檢測(cè)對(duì)診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）、陰性預(yù)測(cè)值（NPV）。結(jié)果 熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA， 其陽(yáng)性對(duì)肺結(jié)核診斷的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 肺結(jié)核組毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性為13.73%， 痰涂片抗酸染色鏡檢敏感性為15.69%。對(duì)照組中， 熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA的特異性為96.67%， 毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性均為100.00%。肺結(jié)核組熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA與痰涂片抗酸染色鏡檢及毛刷涂片抗酸染色鏡檢敏感性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA與毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA有良好的特異性和敏感性， 有望輔助傳統(tǒng)的檢查來早期診斷肺結(jié)核。

【關(guān)鍵詞】 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；支氣管肺泡灌洗液；結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸；肺結(jié)核

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.10.007

【Abstract】 Objective To disucss the clinical value of fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） in detection of mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TbDNA） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods There were 51 pulmonary tuberculosis patients as pulmonary tuberculosis group， and 60 non-pulmonary tuberculosis patients as control group. All patients improved BALF TbDNA detection， brush smear acid-fast staining， sputum smear acid-fast staining， so as to evaluate the sensitivity， specificity， positive predictive value （PPV） and negative predictive value （NPV） of TbDNA detection in BALF for diagnosis of tuberculosis. Results TbDNA in BALF was detected by fluorescence quantitative PCR， and the sensitivity， specificity， PPV and NPV of the positive pulmonary tuberculosis were 74.51%， 96.67%， 95% and 81.69% respectively. In the pulmonary tuberculosis group， the sensitivity of brush smear acid-fast staining was 13.73%， and the sensitivity of sputum smear acid-fast staining was 15.69%. In the control group， the specificity of fluorescence quantitative PCR for detection of TbDNA in BALF was 96.67%. The specificity of brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining were 100.00%. In the pulmonary tuberculosis group， there was statistically significant difference in sensitivity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with sputum smear acid-fast staining and brush smear acid-fast staining （P<0.05）. In the control group， there was no statistically significant difference in specificity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining （P>0.05）. Conclusion Fluorescence quantitative PCR shows good specificity and sensitivity in detection of TbDNA in BALF， and it is expected to assist traditional examination in the early diagnosis of pulmonary tuberculosis.

【Key words】Fluorescence quantitative polymerase chain reaction； Bronchalveolar lavage fluid； Tuberculosis deoxyribonucleic acid； Pulmonary tuberculosis

結(jié)核病是一個(gè)全球性的衛(wèi)生問題， 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)， 其仍然是全世界的首要傳染病殺手， 2013年全球有900萬人患結(jié)核病， 其中死亡150萬人， 且近年來在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行， 呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。控制結(jié)核病的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)， 早隔離和治療活動(dòng)性肺結(jié)核[2]。結(jié)核病可累及全身多臟器， 但以肺結(jié)核最為常見。目前肺結(jié)核的病原學(xué)檢查方法主要包括培養(yǎng)和涂片， 但培養(yǎng)費(fèi)時(shí)， 涂片陽(yáng)性率低， 且肺結(jié)核的臨床癥狀多不典型， 且缺乏特征性的影像學(xué)表現(xiàn)， 因此， 部分肺結(jié)核患者無法得到早期診斷， 甚至出現(xiàn)漏診和誤診。熒光定量PCR檢測(cè)與常規(guī)的檢查方法比較， 敏感度高， 特異性強(qiáng)， 可以檢測(cè)1～100 fg純化結(jié)核分枝桿菌DNA（約相當(dāng)于1～20個(gè)

結(jié)核分枝桿菌菌體的DNA量）[3]。肺泡灌洗液直接取材于遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔， 細(xì)菌含量高， 應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)BALF中的TbDNA， 能輔助傳統(tǒng)的方法早期診斷肺結(jié)核患者。本文收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺結(jié)核患者及60例非肺結(jié)核患者， 所有患者均完善

BALF TbDNA檢測(cè)及支氣管鏡刷檢涂片抗酸染色鏡檢、痰涂片抗酸染色鏡檢， 以評(píng)價(jià)熒光定量PCR檢測(cè)BALF中TbDNA診斷肺結(jié)核的價(jià)值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組， 肺結(jié)核按照《肺結(jié)核診斷和治療指南》診斷[1]， 平均年齡（48.18±17.17）歲；其中男26例， 女25例。另選60例通過相關(guān)檢查及治療排除肺結(jié)核感染的肺部疾病患者作為對(duì)照組， 平均年齡（52.13±

18.01）歲；其中男30例， 女30例；細(xì)菌性肺炎35例， 真菌性肺炎2例， 支氣管擴(kuò)張癥15例， 肺癌5例， 膿胸2例， 氣胸1例。兩組患者的一般資料比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 檢測(cè)方法

1. 2. 1 肺泡灌洗液收集， 常規(guī)氣管鏡下見異常者或者于胸片及胸部CT提示相關(guān)病灶的對(duì)應(yīng)葉段支氣管行灌洗， 無菌灌洗液瓶收集BALF約20 ml， 密閉， 立即送檢， 取5 ml行熒光定量PCR法檢測(cè)TbDNA， 檢測(cè)值≥5.0E+2為陽(yáng)性， <5.0E+2為陰性。

1. 2. 2 氣管鏡下行經(jīng)支氣管鏡防污染刷檢， 涂片送抗酸染色。

1. 2. 3 所有患者痰標(biāo)本均于漱口后留取晨痰， 進(jìn)行抗酸染色后鏡檢， 其中抗酸染色鏡檢找到結(jié)核分枝桿菌為陽(yáng)性， 未找到結(jié)核分枝桿菌為陰性。

1. 2. 4 試劑均采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的TbDNA試劑盒， 嚴(yán)格按照試劑盒的操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA， 其陽(yáng)性對(duì)肺結(jié)核診斷的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為74.51%、96.67%、

95.00%、81.69%， 肺結(jié)核組毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性為13.73%， 痰涂片抗酸染色鏡檢敏感性為15.69%。對(duì)照組中， 熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA的特異性為96.67%， 毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性均為100.00%。肺結(jié)核組熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA與痰涂片抗酸染色鏡檢及毛刷涂片抗酸染色鏡檢敏感性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA與毛刷涂片抗酸染色鏡檢及痰涂片抗酸染色鏡檢的特異性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

3. 1 肺結(jié)核是目前臨床上最常見的慢性傳染性疾病之

一[4]， 探索早期、快速及準(zhǔn)確的肺結(jié)核診斷方法是目前結(jié)核病研究的重點(diǎn)。通常在肺結(jié)核診斷中， 痰和肺泡灌洗液、漿膜腔積液檢測(cè)結(jié)核桿菌屬于最為可靠的檢查方法， 分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量脂類， 不易著色， 但若經(jīng)延長(zhǎng)染色時(shí)間及加溫后， 則不易被酸性脫色劑脫色， 根據(jù)這一原理， 臨床上疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行痰涂片找抗酸桿菌檢查， 操作簡(jiǎn)便， 快速， 是臨床廣泛應(yīng)用的肺結(jié)核診斷方法之一[5]。但本研究顯示， 痰涂片抗酸染色鏡檢方法對(duì)于肺結(jié)核診斷的敏感性僅為15.69%， 與劉潔等[6]及姜廣路等[7]研究相似。其敏感性與排菌量及痰標(biāo)本收集是否恰當(dāng)?shù)扔蟹浅４蟮年P(guān)系， 而且達(dá)到5000～10000 ml濃度才能得到陽(yáng)性結(jié)果[8]， 同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)， 氣管鏡下毛刷涂片抗酸染色鏡檢的敏感性僅為13.73%， 所以， 痰及毛刷抗酸染色鏡檢無法滿足臨床早期診斷的要求。

3. 2 在全國(guó)肺結(jié)核流行病調(diào)查當(dāng)中， 痰菌呈陰性的肺結(jié)核患者占總的結(jié)核病患者的60%～70%， 在實(shí)際臨床應(yīng)用中， 痰菌出現(xiàn)陰性但通過臨床綜合資料確診肺結(jié)核的患者占70%～

80%[9]。近年來， 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展， 分子生物學(xué)技術(shù)如熒光定量PCR逐步應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷中。熒光定量PCR技術(shù)具有高敏感性、高準(zhǔn)確性， 定量范圍廣、操作簡(jiǎn)便、快速安全， 是污染最少的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)[10]。目前， 該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)痰標(biāo)本、外周血及肺泡灌洗液當(dāng)中， 特別是對(duì)于無空洞型、病變范圍較少的含菌量低的標(biāo)本。肺泡灌洗液直接取材于遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔， 其接觸病灶的范圍較廣， 細(xì)菌含量高， 污染幾率較低， 同時(shí)， 灌洗時(shí)可刺激患者咳嗽， 有利于局部支氣管分泌物的引流。本研究顯示， 通過熒光定量PCR檢測(cè)肺泡灌洗液TbDNA的敏感性、特異性、PPV、NPV分別74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 其敏感性顯著高于痰涂片找抗酸桿菌、氣管鏡下毛刷涂片找抗酸桿菌， 與張紅漫等[11]及魏巍等[12]研究相似。熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)BALF中的TbDNA的結(jié)果一般1 d內(nèi)獲得， 對(duì)診斷肺結(jié)核具有快速、敏感、特異的特點(diǎn)， 是一種值得臨床推廣的方法[13]。

3. 3 熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA的敏感性、特異性分別為74.51%、96.67%， 假陰性的原因包括不同人群免疫水平存在差異[6]、標(biāo)本內(nèi)含有大量Taq酶抑制因子抑制了PCR擴(kuò)增[14]及部分病例所感染的結(jié)核分枝桿菌存在IS6110序列的缺失[15]等。本研究肺結(jié)核組共13例患者， 全部患者病程均<4 周， 其中， 9例在完善檢查前曾使用二線抗結(jié)核用藥“左氧氟沙星針”， 假陰性可能與病程較短及受到藥物影響有關(guān)。本研究在對(duì)照組中， 2例患者出現(xiàn)假陽(yáng)性， 考慮可能與以下原因有關(guān)：①標(biāo)本間的污染、標(biāo)本對(duì)試劑的污染[11]；②實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TbDNA不能區(qū)分死菌還是活菌， 因此在一些非結(jié)核感染病灶及一些陳舊結(jié)核灶也有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性[16]；③擴(kuò)增了患者體內(nèi)潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌[14]。對(duì)病情的判斷仍應(yīng)該結(jié)合其他檢查結(jié)果綜合判斷。

綜上所述， 采用熒光定量PCR方法檢測(cè)BALF中的TbDNA不僅快速， 而且敏感性、特異性高， 灌洗更是有利于局部支氣管分泌物的引流， 對(duì)肺結(jié)核特別是影像學(xué)特征不典型及痰涂片檢查陰性的患者， 是一種可以提高確診率有效方法之一， 其結(jié)果可以作為肺結(jié)核的主要診斷依據(jù)指標(biāo)及篩選指標(biāo)。同時(shí)， 可以協(xié)助肺結(jié)核的早期診斷， 值得臨床推廣。以后， 作者將對(duì)該檢查對(duì)肺結(jié)核患者的療效進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察， 以了解其對(duì)抗結(jié)核藥物的使用指導(dǎo)意義。

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[收稿日期：2017-12-04]