Xpert MTB/RIF聯(lián)合T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎及其耐藥性的臨床研究

孫海柏，張麗霞，劉佳慶，郭明日，李玉明，馮冉冉，劉雅，謝怡

（天津市海河醫(yī)院，天津 300350）

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核菌及其代謝物進(jìn)入正處于高度過(guò)敏狀態(tài)的機(jī)體胸膜腔引起的胸膜炎癥，由于治療不及時(shí)或不規(guī)范形成慢性包裹性積液、結(jié)核性膿胸及支氣管漏等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的呼吸功能，甚至可導(dǎo)致死亡[1]。目前診斷方法中抗酸染色陽(yáng)性率極低，僅為0%～25%，胸腔積液及胸膜活檢標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性率低，且培養(yǎng)時(shí)間耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，難以及時(shí)指導(dǎo)臨床治療，診斷金標(biāo)準(zhǔn)的胸膜活檢陽(yáng)性率不高。選擇快速準(zhǔn)確的診斷結(jié)核性胸膜炎的方法尤為重要。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選取2012年6月-2016年10月于天津市海河醫(yī)院就診的結(jié)核性胸膜炎患者101例作為結(jié)核性胸膜炎組，其中男性75例，女性26例；年齡17～83，平均42.3歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、盜汗、疲乏、胸痛、刺激性干咳及結(jié)核中毒等癥狀；②超聲提示有不同程度的胸腔積液，且胸部CT伴有或不伴有結(jié)核病灶；③胸腔積液為滲出液，其中淋巴細(xì)胞增多，所占比例50%；腺苷酸脫氨酶（adenylate deaminase，ADA）≥40 IU/L，抗結(jié)核抗體陽(yáng)性；④胸腔積液涂片或培養(yǎng)結(jié)核桿菌陽(yáng)性；⑤結(jié)核菌素純蛋白衍生物皮試試驗(yàn)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性；⑥胸膜活檢有典型結(jié)核病變（如結(jié)核性肉芽腫或干酪樣病變）；⑦常規(guī)治療無(wú)效，經(jīng)抗結(jié)核治療2～4周好轉(zhuǎn)，最終確診。選取同期院內(nèi)其他疾病合并胸腔積液的患者79例作為對(duì)照組。其中，男性49例，女性30例；年齡21～78歲，平均43.5歲。患者有大葉性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、支氣管肺癌、胸膜轉(zhuǎn)移癌、惡性胸膜間皮瘤及惡性淋巴瘤等疾病，均無(wú)肺結(jié)核及肺外結(jié)核病史。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸腔積液為滲出液，普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性；②胸膜病理學(xué)檢查排除結(jié)核；③無(wú)結(jié)核中毒癥狀；④臨床上可明確胸水為原發(fā)性疾病所致。

1.2　方法

1.2.1標(biāo)本采集兩組在初診時(shí)抽取胸水留取70 ml分裝到4個(gè)5 ml無(wú)菌管和1個(gè)50 ml無(wú)菌容器內(nèi)，第1管進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，第2管進(jìn)行生化免疫實(shí)驗(yàn)，第3管用于利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF），第4管用于常規(guī)檢測(cè)，50 ml無(wú)菌容器用于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測(cè)（detection of T cell spot in tuberculosis，T-SPOT.TB）。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法①結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）檢測(cè)。BACTEC MGIT960培養(yǎng)及耐藥性，按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行操作。②Xpert MTB/RIF檢測(cè)。取1 ml胸水標(biāo)本加入前處理管中，視樣本性狀加入2倍樣本體積的標(biāo)本處理液，渦旋振蕩15～30 s靜置15 min，吸取2 ml處理后樣本緩慢加入反應(yīng)盒，放入檢測(cè)模塊進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。MTB結(jié)果判讀根據(jù)DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低及未檢測(cè)出5個(gè)等級(jí)；利福平藥敏結(jié)果分為：耐藥、未檢出及敏感。③T-SPOT.TB檢測(cè)。采用淋巴細(xì)胞分層液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)并分別定量至2.5×106/ml。分離胸水單個(gè)核細(xì)胞（pleural effusion mononuclear ce11，PEMC），計(jì)數(shù)并分別定量至 2.5×106/ml、2.5×105/ml、2.5×104/ml及2.5×103/ml的細(xì)胞懸液（留取3例結(jié)核性胸膜炎及3例對(duì)照組所致胸腔積液進(jìn)行小樣本預(yù)試驗(yàn)，從而確定大樣本實(shí)驗(yàn)的最佳PEMC濃度）。然后操作步驟完全按照說(shuō)明書要求進(jìn)行操作。

1.2.3儀器與試劑PLR-線性探針雜交酶顯色法診斷試劑盒（德國(guó)Hain Lifescience公司），Hotstar Taq酶（德國(guó)Qiagen公司），MGIT960液體培養(yǎng)基及藥敏管（美國(guó)BD公司），Hain GT Blot-48全自動(dòng)雜交儀（德國(guó)Hain Lifescience公司），PCR儀（德國(guó)Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），生物安全柜（青島海爾公司），結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（上海復(fù)星公司），GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Cepheid公司）。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　兩組患者一般資料比較

兩組患者葡萄糖、腺苷酸脫氨酶（adenylate deaminase，ADA）、抗結(jié)核抗體（anti tuberculosis antibody，TB-Ab）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組患者男女比例、年齡、唾液酸（sialic acid，SA）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、α-羥丁酸脫氫酶（alpha-hydroxybutyric dehydrogenase，HBDH）及白細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2　結(jié)核性胸膜炎組患者Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果分析

Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性分別為82.18%（95%CI：0.78，0.85）和88.12%（95%CI：0.84，0.91），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.591，P=0.018），特異性分別為96.10%（95%CI：0.94，0.98）和 98.73%（95%CI：0.97，0.99），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3　3種檢測(cè)方法對(duì)斷結(jié)核性胸膜炎的結(jié)果分析

以MGIT 960液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF的陽(yáng)性率為79.57%，兩種方法的Kappa值為0.277，一致性較低。以MGIT960檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率為94.62%，兩種方法的Kappa值為0.668，一致性較高。

工作隊(duì)駐村之后，立刻在第一書記王從愿的帶領(lǐng)下，攜手曼來(lái)村“三委”成員，分組入戶，給村民們建檔建案建數(shù)據(jù)，深入了解具體情況。在精準(zhǔn)分析和論證各家的貧困原因及貧困類型后，工作隊(duì)定下了“攻心”“攻新”的扶貧脫貧戰(zhàn)略。

2.4　2種檢測(cè)方法藥敏檢測(cè)結(jié)果分析

101例結(jié)核性胸膜炎的胸腔積液標(biāo)本以藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用Xpert MTB/RIF檢測(cè)101例菌株的利福平耐藥性。其中25例未檢測(cè)出來(lái)，2例為陰性，76例標(biāo)本分別采用BACTEC MU1T960及Xpert MTB/RIF進(jìn)行檢測(cè)，其中70例均耐藥，4例均敏感，兩種方法的kappa值為0.786，具有極好的一致性。

2.5　耐藥基因突變位點(diǎn)分析及構(gòu)成比

對(duì)利福平耐藥陽(yáng)性的6份標(biāo)本進(jìn)行基因突變位點(diǎn)分析。見表2。

表1　兩組患者一般資料比較

表2　耐藥基因突變位點(diǎn)分析及構(gòu)成比

3　結(jié)論

T-SPOT.TB是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)快速診斷結(jié)核病的新技術(shù)，其原理是指當(dāng)人體T細(xì)胞受到結(jié)核菌抗原的再次刺激后，活化的效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵性細(xì)胞因子干擾素-γ[2]。此技術(shù)已經(jīng)很成熟的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，具有較高的敏感度和特異性，且與卡介苗不存在交叉反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)引起臨床越來(lái)越多的重視[3]。對(duì)于患者全血的研究較多，但對(duì)于胸腔積液中干擾素的釋放研究較少，本文收集患者的胸腔積液提取單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以提高診斷的準(zhǔn)確率，診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏性和特異性為96.10%和98.73%，均較高。LEE等[4]對(duì)歐洲及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的胸腔積液進(jìn)行了小樣本研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸水及外周血的T-SPOT.TB檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎均有較好的敏感性、特異性，還有報(bào)道結(jié)核性胸膜炎有較高的陽(yáng)性率達(dá)91.67%，報(bào)告結(jié)論與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相接近，并且在一些研究中也證實(shí)了T-SPOT.TB檢測(cè)在肺外不同部位結(jié)核中的診斷價(jià)值[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道T-SPOT.TB檢測(cè)聯(lián)合ADA檢測(cè)也可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率[6]。Xpert MTB/RIF是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其對(duì)利福平耐藥性的快速分子診斷方法，目前肺外結(jié)核運(yùn)用較多，但是對(duì)胸腔積液的診斷中以金標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)其敏感性較低，當(dāng)胸水中結(jié)核分枝桿菌太少或標(biāo)本中含Taqman抑制物及分枝桿菌DNA提取效率低時(shí)，都有可能出現(xiàn)假陰性[7]。一些文獻(xiàn)中報(bào)道結(jié)核性胸膜炎Xpert MTB/RIF敏感性和特異性分別為28.7%和96.6%，而相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值分別為96.1%和31.1%[8]。此外，近來(lái)應(yīng)用Xpert MTB/RIF檢測(cè)胸膜組織樣本發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF未能檢測(cè)出任何已確診的結(jié)核患者[9]。結(jié)合本文所做測(cè)試結(jié)果，Xpert MTB/RIF對(duì)胸腔積液靈敏度較低（15%～44%），準(zhǔn)確度有限。胸腔積液Xpert MTB/RIF試驗(yàn)不能準(zhǔn)確診斷胸膜結(jié)核，不推薦用作疑似胸膜結(jié)核患者的初始評(píng)價(jià)試驗(yàn)[10]。還有些報(bào)道認(rèn)為Xpert MTB/RIF在非呼吸道標(biāo)本中診斷結(jié)核病的敏感度不一致，但特異性均較高[11-12]。

Xpert MTB/RIF系統(tǒng)是用于檢測(cè)結(jié)核病的分子診斷平臺(tái)，由于大多數(shù)利福平耐藥菌株都對(duì)異煙脅耐藥，因此利福平耐藥情況在一定程度上能作為耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)指標(biāo)[13]。其以通過(guò)rpoB基因RIF的耐藥決定區(qū)的81 bp核心區(qū)為靶序列，能夠在2 h內(nèi)檢測(cè)MTB和利福平的耐藥性[14]。Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥性與MGIT960不一致的情況，可能是由于rpoB區(qū)內(nèi)其他突變所致或者由于其他基因突變導(dǎo)致，理論上標(biāo)本中含有≥1種的MTB混合培養(yǎng)或污染時(shí)，若其中一種有突變探針未涵蓋的突變，將出現(xiàn)野生型帶型[15]。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)Xpert MTB/RIF與金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胸水的檢測(cè)進(jìn)行比較，結(jié)果一致性較好，但是標(biāo)本量較少，有待于進(jìn)一步研究，同時(shí)也值得臨床進(jìn)一步推廣。

綜上所述，T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸水診斷的敏感性及特異性，同時(shí)結(jié)合Xpert MTB/RIF的特異性能對(duì)結(jié)核性胸膜炎作出快速診斷和排除。Xpert MTB/RIF可直接檢測(cè)MTB的核酸并可檢出其對(duì)利福平的耐藥性，使病人得到快速診治。

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