山河陳醋生產中酵母菌產酒產酯特性研究

鄭樹煬，曹彥軍，呂玉柱，郝林*

(1.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷　030801；2.山河醋業(yè)股份有限公司，山西 和順　032700)

山河醋業(yè)有限公司位于山西省晉中市和順縣陽光占鄉(xiāng)陽光占村，其前身為和順縣陽光醋廠。陽光醋廠成立于1978年，是在有幾百年釀醋歷史的“德盛昌”醋坊的基礎上成立的鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)。陽光醋廠出色地傳承和發(fā)展了和順醋的傳統(tǒng)釀造工藝和技能，在20世紀80年代初期，陽光醋廠的產品銷往全國的多個省市，與“水塔”齊名，成為山西老陳醋的代表類產品，后來企業(yè)發(fā)展緩慢，但仍然堅持將山西老陳醋的傳統(tǒng)制作工藝傳承了下來。

大曲質量是決定陳醋品質的內在因素[1]。大曲中微生物種類十分復雜，主要包括細菌、霉菌、酵母菌和放線菌[2,3]。由于菌種多，在釀造過程中生成不同的香氣成分，構成獨特的風味[4]。大曲依靠自然接種，在很大程度上受環(huán)境因素的制約[5]，酒化力低，導致產醋率不高。其中酵母菌是老陳醋生產過程中的功能性微生物之一，除了生成醇之外，還代謝生成醛、酸、酮、酯等香氣成分，這些物質對食醋的風味品質起著重要的作用[6-8]。從山河陳醋大曲中分離酵母菌，并研究酵母菌特性、產酒能力，可為提高大曲質量提供依據，從而提高醋的品質和生產效率。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

大曲、封罐前的酒醪：山河醋業(yè)有限公司；高粱：市售；無水乙醇、硝酸鉀、硝酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸等試劑：均為國產分析純；淀粉酶(20000 U/g)：山東龍元生物工程有限公司；糖化酶(50000 U/g)：湖南新鴻鷹生物工程有限公司。

YEPD液體培養(yǎng)基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，蒸餾水100 mL。YEPD固體培養(yǎng)基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，蒸餾水100 mL。豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽125 g，蒸餾水1000 mL，煮沸0.5 h，過濾取汁。無氮合成培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，磷酸二氫鉀0.15 g，七水硫酸鎂0.05 g，酵母膏0.02 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL。同化氮源基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，磷酸二氫鉀0.15 g，七水硫酸鎂0.05 g，酵母膏0.02 g，瓊脂2 g，氮源2 g，蒸餾水100 mL。醋酸鈉瓊脂固體培養(yǎng)基：葡萄糖0.1 g，氯化鈉0.18 g，酵母膏0.25 g，醋酸鈉0.82 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL。以上培養(yǎng)基均經過115 ℃滅菌20 min。

1.2　儀器與設備

PR-CJT-4超凈工作臺上海普瑞斯儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；GNP-9160電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實驗設備有限公司；722G可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；Trace ISO氣相色譜-質譜聯用儀Thermo Fisher公司。

1.3　方法

1.3.1酵母菌株的分離

分別取25 g大曲、酒醪放入裝有225 mL無菌水中振蕩10 min，靜置30 min，取上清液1 mL裝入盛有9 mL無菌水的試管中進行梯度逐級稀釋，做成10-2～10-7的溶液，吸取各梯度溶液0.2 mL于YEPD固體培養(yǎng)基上涂布均勻，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取光滑、濕潤、粘稠的優(yōu)勢菌落，進一步劃線分離純化后，保藏備用[9-12]。

1.3.2菌株形態(tài)鑒定

菌落形態(tài)：將菌種接到YEPD固體培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落表面、形狀、顏色、邊緣、隆起程度、繁殖方式等。

細胞形態(tài)：挑取單菌落均勻涂載玻片上，于高倍鏡下觀察，記錄菌體形狀、繁殖方式。

假菌絲形態(tài)：將生長旺盛的菌種接到YEPD固體培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，觀察是否有菌絲長出，并在高倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

子囊孢子：將生長旺盛的菌種接到醋酸鈉瓊脂固體培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，挑取單菌落于載玻片上進行簡單染色后在油鏡下進行觀察。

1.3.3生理生化鑒定

糖發(fā)酵實驗：用無菌水將測試糖配成10%的溶液，吸取一定量的糖液分裝于含有杜氏管的豆芽汁試管中，使糖濃度達到2%。將新鮮菌種接入含有不同糖類的豆芽汁試管中，30 ℃培養(yǎng)，每天觀察結果[13]，實驗用的糖類有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉。

氮源同化實驗：將測試菌株接種于無氮合成培養(yǎng)基中，于30 ℃饑餓培養(yǎng)7天。然后接入含有不同氮源的同化氮源基礎培養(yǎng)基的平板中，混勻后靜置，待凝固后置于30 ℃培養(yǎng)3天，觀察并記錄結果，陽性反應者在培養(yǎng)皿中有酵母菌生長[14]，實驗用的氮源有硝酸鉀、硝酸鈉。

1.3.4酵母菌的生產性能測定

耐酒精性能：分別取0.2 mL菌懸液接種到10 mL酒精度分別為9%，11%，13%，15%，17%的YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后在30 ℃培養(yǎng)1天，以滅菌YEPD液體培養(yǎng)基為對照，用分光光度計測量OD600 nm值，并記錄。

產酒、產酯性能：挑取單菌落制備菌懸液，以10%的接種量接種至盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，用8層紗布封口，培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用塑料薄膜封口。由于塑料薄膜有一定的透氣性，每24 h稱重1次，測定CO2失重量，并記錄。2次稱重差值小于0.5 g時視為發(fā)酵結束。測定發(fā)酵液的酒精度及總酯含量。

酒精度：按照GB/T 10345-2007的蒸餾法。總酯：堿液皂化法[15]。

1.3.5揮發(fā)性成分的測定

1.3.5.1發(fā)酵液的制備

將高粱粉碎，用65%的水分浸泡4 h，加入3倍的水煮沸1 h，在90 ℃下加入3%的淀粉酶，水浴直至淀粉全部酶解，待溫度降至60 ℃下再加入0.5%的糖化酶酶解1 h，按10%的接種量接入酵母菌，有氧培養(yǎng)24 h后保鮮膜封口，無氧發(fā)酵7天，采用GC-MS測定揮發(fā)性成分[16-21]。

1.3.5.2氣相色譜條件

TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，不分流，氦氣(He)流速：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃，解吸10 min。起始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min上升至160 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。

1.3.5.3質譜條件

接口溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描范圍35～500 m/z。

1.3.5.4數據檢索

通過計算機對檢出的各組分進行檢索，以Willey和NIST為檢索譜庫。

2　結果與分析

2.1　形態(tài)學鑒定

從大曲、酒醪中分離得到68株具有典型酵母菌特征的菌株。各組中挑選1株代表菌株，共計12株。分別命名為：LY01，LY12，LY14，LY23，LY27，QY03，QY07，QY13，QY15，QY17，QY18，QY20。其結果表明：菌株QY18繁殖方式為裂殖，其他菌株的繁殖方式均為芽殖；菌株LY01，LY12，LY14，LY27，QY07，QY13，QY18產生子囊孢子，其他菌株均不產生子囊孢子；菌株QY03，QY07，QY13，QY17，QY18，QY20形成假菌絲，其他菌株均沒有形成假菌絲。

2.2　生理生化鑒定

糖發(fā)酵實驗中所有菌株均發(fā)酵葡萄糖，均不發(fā)酵可溶性淀粉，菌株QY07不發(fā)酵蔗糖，菌株QY07，QY18不發(fā)酵麥芽糖，菌株QY03，QY17可延遲發(fā)酵麥芽糖；氮源同化實驗中菌株LY01，QY13均可同化硝酸鉀、硝酸鈉，菌株LY12，QY03，QY07，QY18，QY20同化硝酸鉀，其余菌株均不同化。

綜合以上實驗，根據酵母菌的形態(tài)特征與生理生化特性，Bamit的《酵母菌的特征與鑒定手冊》和魏景超的《真菌鑒定手冊》[22]，分離所得12株酵母菌鑒定結果為：LY01，QY13為漢遜酵母屬(Hansenula)；LY23，QY15為克勒克酵母屬(Kloeckera)；LY12，LY14，LY27為酵母屬(Saccharomyces)；QY03，QY17，QY20為假絲酵母屬(Candida)；QY07為畢赤酵母屬(Pichia)；QY18為裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。

2.3　酵母菌的生產性能實驗

2.3.1耐酒精性

圖1　酵母菌的耐酒精性Fig.1 Ethanol tolerance test of yeast

由圖1可知，菌株LY14，LY27，QY15在酒精度為15%時不能生長，菌株LY01，LY12，LY23，QY03，QY17，QY18，QY20在酒精度為13%時不能生長，菌株QY07，QY13在酒精度為9%時不能生長。

2.3.2酵母菌的產酒、產酯能力分析

圖2　酵母菌株產酒精能力Fig.2 Alcohol production capacity of yeast strain

由圖2可知，菌株LY14，QY15產酒精能力強，產酒精度高于9%；菌株LY23，QY13產酒精能力弱，產酒精度低于6.5%；菌株LY01，LY12，LY27，QY03，QY07，QY17，QY18，QY20產酒精能力差異不顯著，產酒精度均在7%～9%之間。

圖3　酵母菌株產酯能力Fig.3 Ester production capability of yeast strain

由圖3可知，菌株QY13產酯能力突出，總酯含量接近0.8 g/dL；菌株LY14，LY27，QY03，QY07，QY15，QY17，QY20產酯能力低弱，總酯含量接近0.6 g/dL；菌株LY01，LY12，LY23，QY18產酯能力差異不顯著，總酯含量高于0.65 g/dL，低于0.75 g/dL。

2.4　揮發(fā)性成分的測定

本實驗采用GC-MS方法對圖3得出的高產酯菌株LY01，LY12，LY23，QY13，QY18的發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分進行分析，以大曲發(fā)酵液為對照。根據風味物質的類別分類，通過峰面積歸一化法計算出各樣品中風味物質的相對含量，色譜圖見圖4，成分分析見表1。

圖4　大曲(A)，LY01(B)，LY12(C)，LY23(D)，QY13(E)，QY18(F)的發(fā)酵液揮發(fā)性香氣成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.4 Volatile aroma components in fermented liquid of Daqu (A), LY01 (B), LY12 (C), LY23 (D), QY13 (E), QY18 (F) analyzed by GC-MS

表1　不同菌株發(fā)酵液香氣成分檢測結果Table 1 Detection results of aroma components in fermented liquid of different strains

續(xù)　表

續(xù)　表

注：“*”表示具有食醋特征性風味的物質；“-”表示沒有檢出。

由表1可知，6種不同發(fā)酵液共檢測出香氣成分84種，其中醇類14種，酯類35種，酸類14種，醛類5種，烷烴類8種，烯烴類2種，酮類3種，雜環(huán)類3種；相同成分有11種，包括醇類3種，分別是乙醇、正戊醇、苯乙醇；酯類5種，分別是醋酸異戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯；醛類、烷烴類、雜環(huán)類各1種，分別是乙縮醛、1-(1-乙氧基)戊烷、2-正戊基呋喃。

大曲發(fā)酵液中共檢測到50種物質，醇類9種，酯類25種，酸類4種，醛類3種，烷烴類5種，烯烴類2種，酮類1種，雜環(huán)類1種。其中草酸含量最高，檢出5種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丁酸[23-26]。

菌株LY01發(fā)酵液中共檢測到38種物質，醇類10種，酯類14種，酸類5種，醛類4種，烷烴類3種，酮類1種，雜環(huán)類1種。其中正戊醇含量最高，檢出6種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株LY12發(fā)酵液中共檢測到40種物質，醇類11種，酯類15種，酸類7種，醛類2種，烷烴類2種，酮類1種，雜環(huán)類2種。其中正戊醇含量最高，檢出5種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、苯乙醛。

菌株LY23發(fā)酵液中共檢測到36種物質，醇類10種，酯類12種，酸類6種，醛類2種，烷烴類4種，酮類1種，雜環(huán)類1種。其中正戊醇含量最高，檢出5種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株QY13發(fā)酵液中共檢測到36種物質，醇類9種，酯類14種，酸類6種，醛類2種，烷烴類2種，酮類1種，雜環(huán)類2種。其中乙酸乙酯含量最高，檢出5種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、2-甲基丁酸。

菌株QY18發(fā)酵液中共檢測到35種物質，醇類9種，酯類17種，酸類3種，醛類2種，烷烴類3種，雜環(huán)類1種。其中正戊醇含量最高，檢出7種具有食醋特征性風味的物質，分別是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

3　結論

本研究從山河陳醋大曲、酒醪中分離得到12株酵母菌，鑒定結果：LY01，QY13為漢遜酵母屬(Hansenula)；LY23，QY15為克勒克酵母屬(Kloeckera)；LY12，LY14，LY27為酵母屬(Saccharomyces)；QY03，QY17，QY20為假絲酵母屬(Candida)；QY07為畢赤酵母屬(Pichia)；QY18為裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。其中，菌株QY15，LY14，LY27產酒性能好，其酒精度分別為9.4%，9.2%，8.8%。菌株QY13，QY18產酯性能突出，其總酯含量分別為0.7832，0.6855 g/dL。采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)對6種高粱發(fā)酵液中檢測出香氣成分84種，其中相同成分有11種。6種發(fā)酵液分別鑒定出香氣物質50種、38種、40種、36種、36種、35種。大曲發(fā)酵液中香氣成分占總揮發(fā)性成分的96.83%，可能因為大曲是自然微生物培養(yǎng)得到的[27]，菌類復雜。菌株QY18發(fā)酵液中香氣成分占總揮發(fā)性成分的99.63%，并檢出7種具有食醋特征性風味的物質，分別為苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛，相對含量分別為3.86%，22.79%，20.27%，0.07%，0.01%，0.14%，0.01%。

本研究可為陳醋生產的菌種選用及工藝改良提供依據。

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