lnc-MGC對高糖誘導的人腹膜間皮細胞轉分化的影響

李歡，何麗潔，婁未娟，王漢民

腹膜透析(PD)是治療終末期腎臟病(ESRD)的一種重要方法，而長期PD可使腹膜超濾功能下降甚至喪失，最終無法進行PD。因此，解決腹膜超濾功能下降或失敗的機制是目前的研究熱點[1]。研究發現干預間皮細胞轉分化可延緩腹膜纖維化[2]，而本實驗組前期研究發現，MicroRNA-199a/214可以介導高糖引起的腹膜損傷和纖維化[3]，血清反應因子(SRF)可通過snail信號通路促進高糖誘導的腹膜間皮細胞轉分化[4]，SRF/miR-143-3p信號通路參與高糖刺激引起人腹膜間皮細胞(HPMCs)的轉分化[5]， lncRNA-MALAT1參與高糖誘導腹膜間皮細胞轉化[6]等，均提示高糖刺激可誘導腹膜間皮細胞轉分化，并且是目前常用的成熟模型。長鏈非編碼RNA(lncRNA)指的是長度超過200nt的RNA分子，它可參與多種生物學過程的調控，如基因沉默、染色體修飾以及轉錄的干擾等[7]。對于lncRNA的作用機制，目前有“microRNA海綿功能”假說，即lncRNA像海綿一樣特異性吸附miRNA，競爭性抑制miRNA與自身靶基因的結合[8]；此外，還有“長鏈非編碼RNA 作為miRNA 產生的前體”的假說[8]。

Kato等[9]在2016年報道lnc-MGC參與了誘發糖尿病腎病的早期病變，并參與調節腎臟纖維化的發生，他們發現Chop基因敲除小鼠可通過lnc-MGC對下游miRNA簇進行負向調控。但目前尚無關于lnc-MGC參與高糖誘導的腹膜纖維化的報道。本研究通過觀察lnc-MGC在高糖誘導的HPMCs轉分化中的作用，為尋找干預或逆轉腹膜纖維化可能的治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HPMCs購自廣州弗爾博生物科技有限公司，DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶(Trypsin)購于澳大利亞Gibco公司，D型-葡萄糖購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒、iso裂解液(DNAiso Reagent)均購自日本TaKaRa公司。調控lnc-MGC的慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司設計并合成，引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。β-actin抗體購自中國Proteintech公司，E-鈣黏素(E-Cadherin)抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、抗結締組織生長因子(CTGF)抗體、抗Ⅰ型膠原蛋白(COL-1)抗體、抗Ⅲ型膠原蛋白(COL-3)抗體均購自英國Abcam公司，SDS-PAGE試劑盒及RIPA裂解液(強)購自碧云天生物技術有限公司，辣根酶標記山羊抗兔/小鼠抗體購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPMCs培養及傳代 將HPMCs接種在25cm2的無菌培養瓶中，采用含10% FBS的DMEM培養基進行培養，置于37℃、5%CO2孵箱中，間隔24h更換培養液，待細胞鋪滿瓶底80%左右時進行傳代。棄去培養液，采用未加FBS的DMEM 1～2ml沖洗瓶底培養基，棄去后每瓶加入胰蛋白酶1.0～1.5ml進行消化，顯微鏡下觀察細胞形態由貼壁的不規則多邊形變為規則的圓形并有大量細胞懸浮時加入含10% FBS的DMEM中和胰蛋白酶，終止消化過程；用無菌吸管輕輕吹打瓶底少量貼壁細胞，并收集入15ml離心管中，800r/min離心5min，加入培養基將細胞重懸，分別鋪入2個25cm2培養瓶或6孔板中，置于孵箱培養。

1.2.2 實驗分組 將HPMCs分為對照組和高糖組，對照組采用含10% FBS的DMEM培養，高糖組在對照組基礎上待細胞完全貼壁后采用60mmol/L高糖培養基培養72h[10]。

1.2.3 總RNA提取 采用iso裂解液手工提取RNA(此方法比試劑盒提取的RNA濃度高)，具體步驟為：取長滿3.5cm2培養皿的細胞，PBS洗3次，加1ml的iso裂解液，靜置冰上裂解3～5min后移入1.5ml EP管，加1/5體積氯仿混勻，4℃下12 000r/min離心30min，取上清(注意勿吸入蛋白)，加等體積異丙醇混勻，4℃下12 000r/min離心15min，棄上清，加1ml無水乙醇，4℃下12 000r/min離心10min，棄上清后室溫干燥，加適量無酶水稀釋，測定總RNA的濃度及純度。

1.2.4 反轉錄及Real-time PCR 按照說明配制20μl反應體系進行反轉錄：37℃ 15min，85℃ 3s，4℃ 60min，反轉錄成cDNA，置于4℃冰箱保存。按照說明配制20μl PCR反應體系，反應條件為：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，共40個循環。

1.2.5 總蛋白提取 取10cm2培養皿中培養好的待檢細胞，用4℃預冷的1×PBS沖洗3次，根據細胞量，加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，靜置于冰上裂解30min，期間可利用超聲再次充分裂解細胞；將裂解液于4℃、12 000r/min離心10min，取上清放入1.5ml EP管中，并加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻置于100℃加熱器中10min將蛋白變性，然后12 000r/min離心10min， –20℃保存。

1.2.6 Western blotting檢測 將蛋白樣品加入SDS凝膠中，加1×電泳液，恒壓(濃縮膠80V，分離膠120V)電泳，結束后轉膜。1×TBST配制10%牛奶封閉1h。1×TBST配制5%牛奶稀釋一抗，加E-Cadherin抗體(1:1000)、抗α-SMA抗體(1:1000)、抗CTGF抗體(1:500)、抗COL-1抗體(1:1000)、抗COL-3抗體(1:1000)、β-actin抗體(1:2000)，4℃搖床孵育過夜。次日，取出條帶，1×TBST洗5min×3次。分別加入相應二抗(1:2000)，室溫孵育1h。1×TBST洗5min×3次。1:1配制顯影液顯影，Image Lab軟件測量條帶的灰度值。

1.2.7 lnc-MGC慢病毒轉染 分別使用上調慢病毒和下調慢病毒對HPMCs進行轉染。取對數生長期HPMCs，調整細胞濃度至5×104個/ml，每孔加1ml細胞懸液。24h后按感染復數(MOI)=30將慢病毒與培養基混勻，加入待轉染細胞中，48h后更換常規液培養。熒光顯微鏡觀察轉染率約90%后將轉染細胞接種于培養瓶中擴增。

1.3 miRBase數據庫預測 采用miRBase數據庫預測lncRNA下游相關miRNA靶分子，預實驗結果發現Lnc-MGC相關的miRNA中miRNA126-3p表達較顯著。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 高糖刺激后lnc-MGC及纖維化相關分子mRNA和蛋白的表達變化 Real-time PCR檢測結果顯示，與對照組比較，高糖刺激后lnc-MGC的表達明顯增加(P=0.0074)；E-Cadherin mRNA表達明顯降低(P<0.05)，而α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，差異均有統計學意義(圖1A)。Western blotting檢測結果顯示，高糖刺激后，纖維化相關分子E-Cadherin蛋白表達明顯降低，而α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯增加，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 高糖刺激后lnc-MGC及纖維化相關分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的變化Fig.1 mRNA (A) and protein (B) expressions of lnc-MGC and fibrosis related molecules after high glucose (HG) stimulation

2.2 lnc-MGC慢病毒轉染的影響

2.2.1 下調lnc-MGC對纖維化相關分子mRNA和蛋白表達的影響 Real-time PCR檢測結果顯示，轉染下調慢病毒后，與對照組相比，lnc-MGC及α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，E-Cadherin mRNA表達明顯升高(P<0.05)，差異均有統計學意義(圖2A)。Western blotting檢測結果顯示，轉染下調慢病毒后，α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯降低，E-Cadherin蛋白表達明顯升高，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2B)。

2.2.2 上調lnc-MGC對纖維化相關分子mRNA和蛋白表達的影響 對HPMCs分別轉染對照慢病毒及過表達慢病毒，Real-time PCR檢測結果顯示，與對照組相比，轉染過表達病毒后，lnc-MGC、α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，E-Cadherin mRNA表達明顯降低(P<0.05)，差異均有統計學意義(圖3A)。Western blotting檢測結果顯示，轉染過表達病毒后，α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯升高，E-Cadherin蛋白表達明顯降低，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3B)。

圖2 下調lnc-MGC對纖維化相關分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響Fig.2 mRNA (A) and protein (B) expressions of fibrosis related molecules after down-regulating lnc-MGC

圖3 上調lnc-MGC對纖維化相關分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響Fig.3 mRNA (A) and protein (B) expressions of fibrosis related molecules after up-regulating lnc-MGC

2.3 lnc-MGC下游靶點預測 采用數據庫miRBase預測得到lnc-MGC下游多個miRNA，其中在慢病毒轉染后，miRNA126-3p有顯著改變，因此考慮lnc-MGC可能對其具有調控作用。故采用Realtime PCR檢測正常組、高糖刺激72h、慢病毒轉染后的miRNA126-3p表達水平，結果顯示，高糖組miRNA126-3p表達明顯高于正常組(P<0.05)。與正常組相比，轉染慢病毒下調lnc-MGC后，miRNA126-3p表達明顯降低(P<0.05)，而上調lnc-MGC后，miRNA126-3p表達則明顯升高(P<0.05，圖4)。

3 討 論

在ESRD患者腎臟替代治療中PD所占比例大于10%[11]。腹膜長期暴露于高糖腹透液中，可發生結構和功能的改變，并逐漸出現腹膜纖維化，進而導致PD功能喪失。因此，探討腹膜纖維化發生發展的機制對行PD的患者來說具有非常重要的意義。目前研究發現lncRNAs與糖尿病腎病、腎小球疾病、急性腎移植排斥反應、腎細胞癌、急性腎損傷都有聯系，例如lncRNA-H19可對抗預防腎纖維化[12]，lncRNA-MALAT1可調節SAA3、IL-6和TNF等炎癥因子的表達[13]，lncRNA-H19參與上皮細胞和間皮細胞之間相互轉化的異常調節[14]， lncRNA-Arid2IR參與了腎臟炎癥和纖維化的過程[15]，LINC01619在糖尿病腎病中可調節miR-27a/FOXO1介導的內質網應激和足細胞損傷[16]。lncRNA調控miRNA參與細胞表型轉化的機制在腹透研究中尚未見報道，但目前在肝癌[17]、肝內膽管癌[18]、胰腺癌[19]、鼻咽癌[20]等研究中已有報道。本研究組已發現的參與腹膜間皮細胞轉分化的分子有lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1[6]，而最新研究發現上調lncRNA-ATB的表達可促進HPMCs表型轉換及增殖[21]。目前這類分子已引起該領域很多學者的關注[22]，并不斷取得新的進展，但有關該類分子在腹膜透析中的研究較少。

圖4 高糖刺激及慢病毒轉染后miRNA126-3p的表達變化Fig.4 Expression of miRNA126-3p after high glucose stimulation and lentivirus transfection

本研究結果顯示，調控上游lncRNA可改變纖維化相關標志物的表達，下游miRNA126-3p可以被正向調控，提示lnc-MGC可通過調控miRNA126-3p來影響腹膜間皮細胞的轉分化。因而本實驗假設與上述“海綿假說”[8]不同。可假設認為lncRNA為miRNA的前體[8]，在成熟過程中剪切產生miRNA，miRNA進而調控下游蛋白發揮作用，影響HPMCs轉分化的過程，影響腹膜纖維化進展。但lnc-MGC通過何種下游靶蛋白來調控纖維化進展，調控或阻斷miRNA126-3p后是否會影響下游靶蛋白，其影響與調控lnc-MGC影響纖維化相關蛋白變化有什么區別，以及對腹膜纖維化進展的影響仍需進一步研究。本課題組下一步將使用雙熒光素酶報告基因來進一步驗證二者的關系。

綜上，本研究結果表明，lnc-MGC在HPMCs轉分化及纖維化中可能發揮著一定的作用，lnc-MGC可通過調控miRNA126-3p來影響腹膜間皮細胞的轉分化，有可能成為干預或逆轉腹膜纖維化治療的重要靶點之一。

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