骨髓增生異常綜合征患者淋巴細胞絕對值計數與地西他濱治療反應的關系

龐艷彬，趙松穎，薛華，郭慧梅，化羅明，范麗霞，羅建民，杜欣

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一組異質性腫瘤性疾病，以骨髓無效造血并伴有向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)轉化的風險為特點[1-2]。目前MDS的唯一治愈方式是異基因造血干細胞移植，其機制在于移植物抗白血病效應的實現，表明患者的免疫功能在MDS的治療中具有重要作用[3]。去甲基化藥物(hypomethylating agents，HMAs)如地西他濱(decitabine，DAC)和阿扎胞苷是近年來MDS治療取得的最大進展[1]。最近研究發現HMAs的作用機制有免疫調控因素的參與，即HMAs誘導內源性反轉錄病毒基因通過模擬病毒感染的方式發揮抗腫瘤效應[4-5]。移植后的淋巴細胞水平與MDS患者免疫狀態密切相關，是反映患者總生存期的預后因素[6]。然而，DAC治療后淋巴細胞計數與治療反應的關系尚不明確。本研究對第1療程DAC治療后28～35d的淋巴細胞(Lym)水平與MDS患者治療反應之間的關系進行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2014年1月－2016年12月在河北大學附屬醫院血液科接受治療的35例MDS患者，隨訪截止時間為2017年3月31日。依據患者病史、外周血細胞計數、骨髓形態學、流式細胞術和細胞遺傳學等檢查結果，所有患者符合MDS的最低診斷標準[7]。納入標準：初治MDS患者且至少經歷2個療程的DAC治療。35例患者年齡42～83(中位值66)歲，其中男26例(74.3%)，女9例(25.7%)。根據MDS 2008診斷標準，35例患者中，難治性貧血或難治性貧血伴多系病態造血或難治性貧血伴環狀鐵粒幼細胞8例(22.9%)，難治性貧血伴原始細胞增多-Ⅰ12例(34.3%)，難治性貧血伴原始細胞增多-Ⅱ6例(17.1%)，MDS轉化AML 9例(25.7%)。

35例患者按照國際預后積分系統(international prognostic scoring system，IPSS)評分分級，低危或中危-Ⅰ者(定義為低危)共9例(25.7%)，中危-Ⅱ或高危的患者(高危)共17例(48.6%)。

1.2 病例分組和指標定義 參考文獻[8]，根據患者在接受第1療程DAC治療后的淋巴細胞計數絕對值，將淋巴細胞計數≥1.2×109個/L的患者分為高淋巴細胞(H-Lym)組(n=15)，將淋巴細胞計數＜1.2×109個/L者分為低淋巴細胞(L-Lym)組。搜集兩組患者的基線資料，包括年齡、性別、診斷時的血常規、骨髓中原始細胞百分比、染色體核型、治療相關死亡率。其中骨髓形態學中根據原始細胞比例分為原始細胞＜10%和原始細胞≥10%；染色體核型特點分為預后良好或中等核型與預后不良核型。根據IPSS積分分為低危和高危或繼發性急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，sAML)。

1.3 治療方案 所有患者均接受DAC治療，15～20mg/(m2.d)，連續1～5d(d1－5)，28d為1個療程。有效患者可重復應用，直至無效。

1.4 療效評價 參照修訂的MDS國際工作組(International Working Group，IWG)提出的關于MDS治療后評價標準進行評估[7]。

形態學完全緩解(CR)定義為骨髓形態學上原始細胞≤5%且中性粒細胞≥1×109個/L，血小板≥100×109個/L；部分緩解(PR)定義為原始細胞較治療前下降≥50%，仍大于5%；穩定指未達到PR，但無疾病進展的證據。

血液學改善(HI)：紅系反應，血紅蛋白治療前＜110g/L者，治療后增加≥15g/L；中性粒細胞反應，治療前＜1×109個/L者，治療后增加＞0.5×109個/L； 血小板反應，治療前＜100×109/L，且＞20×109個/L 者，治療后凈增≥30×109個/L，或治療前血小板＜20×109個/L者，治療后血小板＞20×109個/L，且增幅≥100%。

疾病進展(PD)定義：骨髓原始細胞計數增加≥50%，達到或超過治療前水平，血小板或中性粒細胞計數較最高值減少大于等于50%，血紅蛋白減少≥20g/L。總反應率(ORR)：治療后患者達到CR、PR和血液學改善。無進展生存期(PFS)：從進入治療試驗到PD或因MDS死亡的時間。治療相關死亡：DAC治療過程中或治療結束30d內因骨髓抑制導致的死亡。

1.5 H-Lym組與L-Lym組在第1個DAC療程后淋巴細胞計數的差異 分別記錄診斷時患者血常規中淋巴細胞計數和第1個療程DAC治療后28～35d淋巴細胞計數，分析兩組患者第1療程DAC治療后淋巴細胞的變化特點。

1.6 H-Lym組與L-Lym組患者對DAC治療反應的差異 在至少2個療程DAC治療后，觀察患者達到最佳治療反應時的血常規特點、骨髓細胞形態學變化。根據IWG提出的MDS評價標準進行評估，分析患者治療反應與第1次DAC治療后28～35d外周血中淋巴細胞數目、診斷時骨髓原始細胞比例、染色體核型、IPSS分層之間的關系。

1.7 H-Lym與L-Lym患者PFS的差異及可能危險因素分析 在患者經歷至少2個療程DAC治療后，觀察和記錄達到最佳治療反應時的血常規特點、骨髓細胞形態學變化及病情進展時間。根據IWG提出的MDS評價標準進行評估。分析第1次DAC治療后28～35d患者外周血淋巴細胞計數、骨髓原始細胞比例、染色體核型、IPSS分層對DAC治療后患者無進展生存期的影響。

1.8 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計量資料呈正態分布的情況下以±s表示，若呈方差齊性，采用兩樣本t檢驗比較。采用Pearson χ2檢驗對計數資料進行比較。采用Kaplan-Meier法繪制患者PFS曲線并應用log-rank檢驗進行兩組間比較。均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者基線資料 35例患者共接受了158個療程的DAC治療，療程2～10個(中位值4個)。H-Lym組基線淋巴細胞計數為(1.37±0.70)×109個/L，L-Lym組基線淋巴細胞計數為(1.24±0.53)×109個/L，兩組基線淋巴細胞計數差異無統計學意義(P=0.533，表1)。兩組患者基線年齡、性別、疾病構成、中性粒細胞、血紅蛋白、血小板、染色體核型及治療相關死亡率等的差異無統計學意義(表1)。H-Lym組中骨髓原始細胞≥10%的比例高于L-Lym組患者(P=0.014，表1)。

2.2 兩組患者在第1個DAC療程后淋巴細胞計數的差異 在第1個DAC療程后28～35d，H-Lym淋巴細胞計數為(1.57±0.72)×109個/L，與其基線值(1.37±0.70)×109個/L比較差異無統計學意義(P=0.072)。L-Lym組為(0.79±0.22)×109個/L，與其基線值(1.24±0.53×109/L)比較差異有統計學意義(P=0.006)。

2.3 兩組患者對第1個療程DAC治療反應的差異H-Lym組ORR為80.0%(12/15)，L-Lym組ORR為40.0%(8/20)，兩組差異有統計學意義(P=0.018)。由表2可見，在可能影響DAC患者療效的影響因素中，第1個DAC療程后淋巴細胞計數與患者對治療的反應相關(P<0.05)。此外，IPSS高危組MDS或sAML患者對DAC反應率明顯高于低危組MDS患者(69.6% vs.33.3%，P=0.04)，骨髓原始細胞比例高的患者或具有不良預后染色體核型的患者易于產生治療反應，但是差異無統計學意義(表2)。

表1 兩組患者基線資料及治療相關死亡率比較Tab.1 Baseline data and mortality after entire courses of DAC therapy of two groups

2.4 兩組患者累積生存率的差異及相關危險因素的單因素分析 由表3可見，截至2017年3月31日隨訪結束，H-Lym組患者中位PFS值為10個月(95%CI 7.6～12.4)，明顯優于L-Lym組的7.6個月(95%CI 3.5～11.6)。生存曲線顯示兩組患者的累積生存率差異有統計學意義(P=0.017，圖1)。骨髓原始細胞≥10%組患者PFS略高于骨髓原始細胞＜10%組，但差異無統計學意義(P=0.411)。不同染色體核型(P=0.708)、IPSS分級(P=0.236)的患者PFS差異并無統計學意義(表3)。單因素分析顯示，淋巴細胞計數絕對值低是患者疾病進展的預后因素(P<0.05)。

3 討 論

盡管已明確遺傳學和分子學異常在MDS的疾病進展中發揮著重要作用，但目前越來越多的基礎研究和大樣本流行病學研究發現免疫機制也參與了該過程[9-10]。異基因造血干細胞移植治愈MDS的重要原因是移植物抗白血病效應的實現，說明免疫功能在MDS治療中具有重要的作用[3]。目前作為指導MDS治療選擇的評估模型，無論是使用最廣泛的IPSS積分系統還是修訂后的IPSS積分系統，均不能反映患者免疫狀態在治療中作用[8]。去甲基化藥物(HMAs)如DAC是近年來MDS最重要的治療進展，其作用機制有免疫因素的參與，而淋巴細胞恢復是反映MDS、AML患者免疫恢復的重要指標[6,11]。因此本研究分析了首次DAC治療后28～35d淋巴細胞與患者治療反應之間的關系。

表2 臨床指標與MDS患者治療反應的關系Tab.2 Relationship between clinical parameters and the therapeutic response of MDS patients

圖1 H-Lym和L-Lym組患者的生存曲線 Fig.1 Survival curves of patients in H-Lym and L-Lym group

表3 MDS患者PFS危險因素的單因素分析Tab.3 Univariate analysis for the risk factors influencing the progression-free survival of MDS patients

本研究發現，第1療程DAC治療后28～35d血常規中的淋巴細胞計數與患者的治療反應密切相關，H-Lym組患者對DAC反應率和PFS明顯優于L-Lym組(P＜0.05)。H-Lym組治療后與L-Lym組治療前淋巴細胞水平無明顯差異(P＞0.05)，H-Lym組患者治療前后淋巴細胞計數無明顯變化，L-Lym組患者治療后淋巴細胞計數較治療前明顯下降 (P＜0.05)，提示DAC治療后淋巴細胞減少可能導致患者治療反應低下。本研究結果與Saeed等[8]的889例MDS患者分析結果一致，該研究發現高淋巴細胞計數患者中位PFS優于低淋巴細胞計數患者(35個月vs 26個月，P＜0.05)，低淋巴細胞計數患者死亡風險比為1.3倍(95%CI 1.2～1.6，P＜0.05)。在AML中也有類似結果，Behl等[12]對103例AML患者鞏固治療前患者的淋巴細胞計數進行分析發現，高淋巴細胞計數患者具有較好的完全緩解期和總生存期。DAC治療后高淋巴細胞計數的患者具有較好的治療效果可能與DAC的作用機制有關。HMAs抗腫瘤效應有免疫調節機制的參與：內源性反轉錄病毒(endogenous retrovirus，EDV)基因由于啟動子高度甲基化而不表達，HMASs使EDV基因的啟動子去甲基化，進而發生雙向轉錄，正義和反義RNA形成雙鏈RNA(dsRNA)，dsRNA與胞質中的感應蛋白Toll樣受體3(TLR-3)和黑色素瘤分化基因5(MDA5)結合，在線粒體上的線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)協助下使轉錄因子干擾素調節因子(IRF)3、IRF7和核因子κB(NF-κB)轉移到細胞核內，誘導Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子表 達[4-5]。Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子除激活腫瘤細胞內的JAK/STAT信號通路發揮抗腫瘤效應外，還可能誘導腫瘤細胞釋放趨化因子，誘導T細胞進入腫瘤細胞微環境后增殖、活化，從而發揮抗腫瘤效應[4-5,13]。這說明足夠數量的免疫細胞可能是DAC治療成功的重要因素。

此外，H-Lym組中高危MDS或sAML患者的比例、具有不良預后核型患者的比例高于L-Lym組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。盡管高危組MDS或sAML、骨髓原始細胞比例高和具有不良預后核型的患者容易對DAC治療產生反應，但患者的PFS并未提高(P＞0.05)，其原因可能是DAC使患者造血獲得改善，但并不能清除白血病細胞[13]。其潛在的機制可能是DAC誘導腫瘤細胞釋放干擾素和促炎因子發生抗腫瘤效應的同時，也誘導腫瘤細胞上的程序性細胞死亡因子1(PD-1)、程序性細胞死亡因子配體1(PD-L1)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)等免疫抑制分子表達升高，使腫瘤細胞發生免疫逃逸，導致疾病的進展[14]。因此，HMAs藥物治療失敗后進行聯合免疫檢查點阻滯劑的嘗試性治療正在探索中：最近一項含有MDS和急性白血病的Ⅰ期臨床試驗結果表明，抗CTLA-4單克隆抗體可使部分MDS/AML患者產生治療反應，其中1例MDS轉化的sAML緩解期超過15個月，盡管樣本數量很少，至少說明這種治療策略有潛在臨床研究價值[3]。

本研究尚且存在幾點不足：第一，雖然本研究直接采用1.2×109/L作為臨界值能反映患者的治療效果，但是采用ROC曲線或淋巴細胞計數的中位值計算出的淋巴細胞計數可能能更準確地反映DAC的治療效果，但是由于本研究的樣本例數較少，未能計算最佳臨界值，因此，有必要進一步擴大樣本量以計算反映DAC治療反應的最佳臨界值，并進行多因素分析。第二，H-Lym組ORR為80%，而L-Lym組中也有40%患者獲得治療反應，說明還有其他因素對患者的治療反應產生影響，需要進一步研究確定。第三，本研究應用第1療程DAC治療后的淋巴細胞計數對患者治療反應和FPS進行初步分析，并不能反映不同亞型淋巴細胞在DAC治療反應中的作用。因此，有必要進一步應用流式細胞儀分析不同亞型淋巴細胞預測患者對DAC治療反應的價值。

總之，本研究表明第1療程DAC治療后淋巴細胞水平與MDS患者的治療反應和PFS密切相關。對于第1療程DAC治療后淋巴細胞計數較低的患者可及早調整治療方案以延緩疾病進展。

【參考文獻】

[1] Greenberg PL, Stone RM, Al-Kali A, et al.Myelodysplastic syndromes, version 2.2017 NCCN clinical practice guidelines in oncology[J].J Natl Compr Canc Netw, 2017, 15(1): 60-87.

[2] Dong Z, Qiao JH, Yu CL, et al.Transplantation of nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cells for myelodysplastic syndrome[J].Med J Chin PLA, 2014, 39(1): 48-51.[董征, 喬建輝, 余長林, 等.非清髓異基因造血干細胞移植治療骨髓增生異常綜合征的療效觀察[J].解放軍醫學雜志, 2014, 39(1): 48-51.]

[3] Davids MS, Kim HT, Bachireddy P, et al.Ipilimumab for patients with relapse after allogeneic transplantation[J].N Engl J Med, 2016, 375(2): 143-153.

[4] Roulois D, Loo Yau H, Singhania R, et al.DNA- demethylating agents target colorectal cancer cells by inducing viral mimicry by endogenous transcripts[J].Cell, 2015, 162(5): 961-973.

[5] Chiappinelli KB, Strissel PL, Desrichard A, et al.Inhibiting DNA methylation causes an interferon response in cancer via dsRNA including endogenous retroviruses[J].Cell, 2015, 162(5): 974-986.

[6] Chang YJ, Zhao XY, Xu LP, et al.Early lymphocyte recovery predicts superior overall survival after unmanipulated haploidentical blood and marrow transplant for myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia evolving from myelodysplastic syndrome[J].Leuk Lymphoma, 2013, 54(12): 2671-2677.

[7] Cheson BD, Greenberg PL, Bennett JM, et al.Clinical application and proposal for modification of the International Working Group (IWG) response criteria in myelodysplasia[J].Blood, 2006, 108(2): 419-425.

[8] Saeed L, Patnaik MM, Begna KH, et al.Prognostic relevance of lymphocytopenia, monocytopenia and lymphocyte-to-monocyte ratio in primary myelodysplastic syndromes: a single center experience in 889 patients[J].Blood Cancer J, 2017, 7(3): e550.

[9] Glenth?j A, ?rskov AD, Hansen JW, et al.Immune mechanisms in myelodysplastic syndrome[J].Int J Mol Sci, 2016, 17(6): 944.

[10] Yang H, Bueso-Ramos C, DiNardo C, et al.Expression of PDL1, PD-L2, PD-1 and CTLA4 in myelodysplastic syndromes is enhanced by treatment with hypomethylating agents[J].Leukemia, 2014, 28(6): 1280-1288.

[11] Wolff F, Leisch M, Greil R, et al.The double-edged sword of (re)expression of genes by hypomethylating agents: from viral mimicry to exploitation as priming agents for targeted immune checkpoint modulation[J].Cell Commun Signal, 2017, 15(1): 13.

[12] Behl D, Porrata LF, Markovic SN, et al.Absolute lymphocyte count recovery after induction chemotherapy predicts superior survival in acute myelogenous leukemia[J].Leukemia, 2006, 20(1): 29-34.

[13] Zhang Z, Chang CK, He Q, et al.Increased PD-1/STAT1 ratio may account for the survival benefit in decitabine therapy for lower risk myelodysplastic syndrome[J].Leuk Lymphoma, 2017, 58(4): 969-978.

[14] Sistigu A, Yamazaki T, Vacchelli E, et al.Cancer cell–autonomous contribution of type Ⅰ interferon signaling to the efficacy of chemotherapy[J].Nat Med, 2014, 20(11): 1301-1309.