丁酸對(duì)新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎新生小鼠模型的保護(hù)作用

李秋平，余加林，胡坤，賀雨，肖灑，侯婷，艾青

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒期常見且極為嚴(yán)重的胃腸道急癥，在出生體重低于1500g的早產(chǎn)兒中發(fā)病率達(dá)7%，病死率可達(dá)20%～30%[1]。病情較重者須手術(shù)切除壞死腸組織，但術(shù)后常常發(fā)生短腸綜合征等后遺癥。目前研究認(rèn)為菌群定植紊亂、腸黏膜免疫應(yīng)激性增高等都是NEC的發(fā)病危險(xiǎn)因素[2]。腸道菌群的異常定植與NEC的發(fā)生有著密切關(guān)系。而腸道細(xì)菌又往往是通過其代謝產(chǎn)物來影響機(jī)體功能的。短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)是細(xì)菌分解寡糖的產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。丁酸是SCFA的代表，本研究以丁酸作為干預(yù)劑，建立NEC小鼠動(dòng)物模型，探討丁酸在NEC新生鼠模型中的保護(hù)作用，并分析其可能的作用機(jī)制，為NEC的治療提供新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 60只清潔級(jí)新生3d的C57BL/6新生小鼠，雌雄不限，體重1.5～3.0g(重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，中國)。雅培嬰幼兒奶粉(雅培公司，美國)，貝克幼犬奶粉(貝克公司，美國)，組織及細(xì)胞裂解液(RayBiotech公司，美國)，紅細(xì)胞裂解液(天根公司，中國)，丁酸鈉(上海生物工程公司股份有限公司，中國)，HBSS平衡鹽溶液(Gibco公司，美國)，膠原酶、DNA酶(Sigma-Aldrich公司，美國)，PMSF蛋白酶抑制劑混合物(碧云天公司，中國)。組織RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)，IL-10、TGF-β1ELISA檢測試劑(北京四正柏生物科技有限公司，中國)，Permeabilization Buffer 10X(eBioscience公司，美國)，流式抗體CD3 (clone 500A2)、CD4(clone GK1.5)、FOXP3(clone FJK-16S)(BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 60只3日齡C57BL/6新生小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成丁酸組和PBS組(n=30)。丁酸鈉(上海生物工程公司股份有限公司)配置成150mmol/L的溶液，調(diào)節(jié)pH至中性(pH 7.0)[3]。 生后第3天開始連續(xù)7d予以PBS、丁酸灌胃，再連續(xù)3d建立新生鼠NEC模型。具體建模方法：10日齡的C57BL/6新生小鼠放置在自制保育箱內(nèi)，控制保育箱內(nèi)溫度36±1℃，濕度45%～60%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道配制代乳品，經(jīng)口插入PICC管灌胃喂養(yǎng)。喂養(yǎng)量為0.03～0.05ml/g，每4h喂養(yǎng)1次[4]。將新生鼠放入自制的缺氧箱內(nèi)，向箱內(nèi)充入純氮(100% N2)，控制N2流量為10L當(dāng)測氧儀/min，測得箱內(nèi)O2濃度降為零時(shí)開始計(jì)時(shí)，1min后關(guān)閉閥門并將新生鼠取出。5min后立即將其置于4℃冰箱中刺激10min。缺氧、冷刺激每日2次。

1.2.2 新生鼠一般狀況 觀察新生鼠有無腹脹、腹瀉及血便，活動(dòng)是否良好等情況。

1.2.3 新生鼠腸組織大體形態(tài) 兩組小鼠NEC建模后隔夜處死，取出十二指腸下端至回盲部腸管，肉眼觀察有無腸腔積氣、出血、壞死等NEC樣病變。取小鼠近回盲部1～2cm腸組織，立即將其固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化。參照Dvorak等[5]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)，采用雙盲法進(jìn)行腸組織損傷評(píng)分，評(píng)分≥2分確定為NEC。每例組織標(biāo)本觀察3個(gè)視野，取其平均值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1水平 從–80℃取出凍存的腸組織，提取總RNA，所有步驟嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)說明書操作。Nanodrop 2000測定每個(gè)樣本RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)進(jìn)行操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，在Bio-Rad CFX90 Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s、56℃退火5s、65℃延伸5s，共39個(gè)循環(huán)。采用 2–ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值－內(nèi)參Ct值)進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析，以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH，上游引物：5'-TGCCCCCATGTTTGTGATG-3'，下游引物：5'-TGTGGTCATGAGCCCTTCC-3'，片段 大小151bp；IL-6，上游引物：5'-ACAACCACGGC CTTCCCTACTT-3'，下游引物：5'-CACGATTTCC CAGAGAACATGTG-3'，片段大小129bp；IL-10，上游引物：5'-GCCGTCATTTTCTGCCTCAT-3'，下游引物：5'-GCTTCCCTATGGCCCTCATT-3'，片段大小131bp；TNF-α，上游引物：5'-ATGGCCTCCC TCTCATCAGTT-3'，下游引物：5'-ACAGGCTTGT CACTCGAATTTTG-3'，片段大小80bp；TGF-β1，上游引物：5'-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3'，下游引物：5'-GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3'，片段大小133bp。

1.2.5 ELISA檢測腸組織IL-10、TGF-β1蛋白表達(dá)水平 從–80℃冰箱取出凍存的腸組織，按照20mg加入100μl組織裂解液的比例加入組織裂解液，同時(shí)加入相應(yīng)體積的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)，組織勻漿，4℃、14 000×g離心10min，取上清液，保存于–20℃。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定IL-10、TGF-β1水平，嚴(yán)格按照試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)說明書操作。

1.2.6 小鼠腸道黏膜固有層淋巴細(xì)胞(intestinal lamina propria lymphocytes，LPL)分離及流式細(xì)胞儀檢測腸道固有層Treg數(shù)量 取小鼠腸組織標(biāo)本，加入HBSS平衡液及消化液得到LPL，總體積保證每個(gè)上樣管細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)，加入表染抗體2μl，孵育20min；PBS洗滌2次，加入400μl固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，旋渦混勻，避光4℃孵育45min，加入1ml緩沖液(Permeabilization Buffer)洗滌2次，加入細(xì)胞內(nèi)染色抗體2μl，避光4℃孵育45min，加入1ml緩沖液(Permeabilization Buffer)洗滌2次，200μl PBS重懸細(xì)胞，于BD FACSCanto Ⅱ儀器上機(jī)檢測并分析。小鼠腸固有層Treg細(xì)胞流式標(biāo)記法：CD3-PB、CD4-FITC、Foxp3-PE。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism software version 6作圖，流式圖采用FlowJo-V10，并采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)定量資料進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；正態(tài)方差不齊的計(jì)量資料采用中位數(shù)M(Q)表示，正態(tài)方差不齊組間比較采用Wilcoxon Mann-Whitney檢驗(yàn)。生存分析采用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 兩組小鼠體重及生存分析Fig.1 Weight and survival analysis of two groups

2 結(jié) 果

2.1 新生鼠體重變化及生存情況 由圖1所示，建模第1、2、3天，兩組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取標(biāo)本時(shí)，丁酸組體重(4.50±0.42g)明顯高于PBS組(4.16±0.60g)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而丁酸組生存率(76.34%)與PBS組(67.95%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 腸組織大體形態(tài)、病理學(xué)形態(tài)及病理損傷評(píng)分 肉眼觀察顯示，丁酸組稍有積氣及水腫，無出血(圖2A)；PBS組新生鼠腸組織腸腔有積氣，部分有串珠樣改變(圖2B)。光鏡下觀察可見，丁酸組絨毛相對(duì)完整，肌層較厚(圖2C)；PBS組絨毛變性水腫，部分絨毛壞死、脫落或消失，肌層變薄甚至斷裂(圖2D)。光鏡下腸組織病理損傷評(píng)分結(jié)果顯示，丁酸組腸組織損傷評(píng)分中位數(shù)為1.33(1.33～1.67)，明顯低于PBS組2.00(1.67～2.25，P<0.05)。

2.3 qPCR檢測IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β1基因水平 與PBS組相比，丁酸組腸組織IL-6 mRNA(0.85±0.30 vs.1.77±0.49，P<0.05)及TNF-α mRNA(0.41±0.25 vs.0.96±0.56，P<0.05)表達(dá)水平明顯降低，而IL-10 mRNA(1.91±0.82 vs.0.94±0.43，P<0.05)及TGF-β1mRNA(1.46±0.57 vs.0.88±0.29，P<0.05)表達(dá)水平明顯升高(圖3)。

2.4 ELISA檢測小鼠腸組織炎癥抑制因子IL-10、TGF-β1水平 與PBS組相比，丁酸組腸組織IL-10蛋白表達(dá)水平(68.60±15.06 vs.37.25±5.81)及TGF-β1蛋白表達(dá)水平(424.93±19.34 vs.127.31±60.83)明顯升高(P<0.05，圖4)。

2.5 腸道固有層Treg數(shù)量百分比的比較 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，丁酸組Treg細(xì)胞所占百分比(12.68%±6.79%)明顯高于PBS組(3.57%±0.88%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖2 兩組腸組織肉眼及病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Visual and histopathological observation of intestinal tissue in two groups

圖3 兩組IL-6、IL-10、TGF-β1及TNF-α mRNA表達(dá)水平比較(qPCR)Fig.3 Expression of IL-6, IL-10, TGF-β1 and TNF-α mRNA in two groups (qPCR)

圖4 兩組IL-10、TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較(ELISA)Fig.4 Expression of IL-10, TGF-β1 protein in two groups (ELISA)

圖5 兩組腸道固有層Treg細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的比較Fig.5 Expressed number of Treg cells in gut lamina propria in two groups

3 討 論

NEC是新生兒病房中常見的危重癥，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前研究認(rèn)為腸道功能不成熟、腸血流灌注失衡、異常腸道菌群定植、感染等都是NEC的發(fā)病危險(xiǎn)因素[6]。目前普遍認(rèn)為NEC的發(fā)生與腸道菌群相關(guān)。Warner等[7]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NEC患兒腸道菌群中變形菌門比例明顯增加，而厚壁菌門比例則明顯下降。而且腸道菌群定植的異常也會(huì)引起代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)變化。丁酸主要是由腸道中厚壁菌門、擬桿菌門代謝產(chǎn)生[8]，是腸上皮細(xì)胞最重要的能量來源，還可以促進(jìn)干細(xì)胞增殖，增加隱窩深度和小腸絨毛長度，促進(jìn)分泌性黏蛋白增多[9-10]。丁酸促進(jìn)腸上皮細(xì)胞(IESs)間的緊密連接，降低腸道通透性，減少有害物質(zhì)(如脂多糖LPS)入血，減少促炎因子的生成[11]。給無菌小鼠飲用含有丁酸鈉的水可以增加小鼠腸黏膜固有層的Treg細(xì)胞數(shù)量，并且增強(qiáng)Treg細(xì)胞對(duì)炎癥抑制因子IL-10的合成[12]。本實(shí)驗(yàn)表明，丁酸組小鼠在體重、生存情況、腸道大體形態(tài)及腸組織病理學(xué)損傷等方面均明顯好于正常對(duì)照組。可能的原因?yàn)椋憾∷崾且环N弱酸(pH=4.8)，通過簡單擴(kuò)散、逆轉(zhuǎn)運(yùn)及載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腸上皮細(xì)胞發(fā)揮作用[13]；丁酸對(duì)組蛋白去乙酰化酶的抑制作用可以激活腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(AP-1)信號(hào)通路，從而抑制促炎因子IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，從而起到抗炎作用[14]；丁酸對(duì)組蛋白去乙酰化酶的抑制作用還可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖活化，促進(jìn)Treg細(xì)胞相關(guān)的IL-10、TGF-β1抗炎因子的表達(dá)升高，從而發(fā)揮其抑制炎癥反應(yīng)的作用。Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制作用的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，其通過抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化來發(fā)揮免疫抑制作用。qPCR結(jié)果顯示，與PBS組相比，丁酸組炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)降低，IL-10、TGF-β1抑炎因子表達(dá)水平升高。ELISA結(jié)果顯示，丁酸組IL-10、TGF-β1蛋白水平表達(dá)明顯高于PBS組。流式結(jié)果顯示丁酸組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例較PBS組高，提示丁酸促進(jìn)了CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化。

綜上所述，丁酸是重要的腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)物，具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生物等功能，對(duì)維持腸道乃至機(jī)體的免疫平衡有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)成功建立了NEC動(dòng)物模型；檢測了Treg細(xì)胞數(shù)量及IL-10、TGF-β1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸可通過促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化以及與Treg細(xì)胞相關(guān)的IL-10、TGF-β1的表達(dá)升高，從而發(fā)揮其抑制炎癥反應(yīng)的作用。目前針對(duì)丁酸生理作用的具體機(jī)制的研究還不完善，有關(guān)丁酸對(duì)生理調(diào)節(jié)作用的研究多為幼畜，且缺乏大規(guī)模臨床試驗(yàn)的報(bào)道。本研究中丁酸對(duì)炎癥的抑制作用以及對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用為臨床NEC患兒的治療提供了新的途徑。目前關(guān)于丁酸結(jié)合具體的動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)的研究未見大量報(bào)道，因此尚須進(jìn)行大量動(dòng)物和臨床研究以進(jìn)一步證實(shí)其作用及機(jī)制。

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