PI3K/AKT信號通路與HER2陽性乳腺癌患者總生存時間的相關(guān)性及驗證分析

李慧，李春曉，南鵬，王婷，王勁松，張競堯，竇娜，馬飛，王海娟，錢海利，詹啟敏

乳腺癌是女性最常見的腫瘤，其發(fā)病率在女性腫瘤中占第一位[1]，死亡率占第二位，僅次于肺癌[1]， 其中人表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性乳腺癌約占全部乳腺癌的20%[2]。HER2是一種膜受體酪氨酸激酶，通過激活下游通路磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein Kinase B，PKB，又稱AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)來調(diào)控細胞增殖及存活能力[3]，是HER2陽性乳腺癌患者治療的一個關(guān)鍵且有效的靶點[4]。隨著抗HER2靶向治療的發(fā)展日趨成熟，該型患者的治療效果也得到有效改善。據(jù)報道，在抗HER2靶向治療下，41%的HER2陽性乳腺癌患者腫瘤癥狀獲得完全緩解[5]，尤其是早中期乳腺癌患者生存期延長更加明顯[6]。但并非所有HER2陽性患者均能從抗HER2治療中獲益，仍有一些患者的總生存期極短[6]，其主要原因之一便是抗HER2治療耐藥[7]，這可能是HER2基因突變導(dǎo)致蛋白構(gòu)象改變引發(fā)的治療性耐藥現(xiàn)象[8]，也可能是抗HER2治療常用藥物曲妥珠單抗與HER2蛋白結(jié)合受阻導(dǎo)致的耐藥[9]。所以，闡明抗HER2治療耐藥的機制將為HER2陽性乳腺癌耐藥患者的治療提供新的靶標和治療思路。但迄今為止抗HER2治療耐藥的具體機制還不甚清楚，現(xiàn)有研究亦局限于體外實驗或小樣本研究，仍然缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持。

為此，本研究從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫收錄的1105例乳腺癌患者中遴選了所有HER2陽性乳腺癌患者181例，對其生存時間及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，尋找與HER2陽性乳腺癌患者總生存時間相關(guān)的候選通路，并在KMplot(Kaplan Meier-plotter)數(shù)據(jù)庫中驗證候選通路關(guān)鍵節(jié)點基因及通路其他基因與患者總生存時間的相關(guān)性，在HER2陽性乳腺癌細胞系中驗證候選通路與抗HER2治療耐藥的相關(guān)性，期望有助于闡明抗HER2治療耐藥的機制，為抗HER2治療耐藥機制的研究和HER2陽性乳腺癌患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及材料 HER2陽性人乳腺癌細胞系BT474保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，細胞置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)。HER2小分子抑制劑拉帕替尼(lapatinib，Cat Num: S2111)購自美國Selleck公司；PI3K抑制劑(PI103，Cat Num: S1038)購自美國Selleck公司。

1.2 藥物對細胞的生長抑制作用檢測 利用實時細胞分析儀(real-time cell analyzer，RTCA； xCELLigence 檢測系統(tǒng)，杭州艾森生物有限公司)檢測細胞阻抗值并以此計算細胞指數(shù)(cell index)以反映細胞增殖數(shù)目。將對數(shù)生長期的BT474細胞消化并接種于該儀器配置的含微陣列檢測電極的細胞增殖培養(yǎng)板 E-Plate S16(16孔板)中，每孔1×104個細胞，細胞培養(yǎng)24h狀態(tài)恢復(fù)后分別加入不同濃度的目的藥物，之后每隔1h檢測一次，計算細胞指數(shù)，指示細胞生長狀況。

1.3 檢測指標及項目

1.3.1 HER2陽性乳腺癌患者總生存(overall survival, OS)及實驗分組 選擇TCGA 數(shù)據(jù)庫中含1105例乳腺癌患者的暫時(provisional)人群，其中OS信息完整的女性HER2陽性乳腺癌患者181例，對其進行OS分析。將其中Ⅰ/Ⅱ期的128例患者根據(jù)OS分為<2年(A1組)和>8.5年(A2組)兩組，對兩組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較；另外將其中Ⅲ/Ⅳ期的53例患者根據(jù)OS分為<2年(B1)和>7年(B2)兩組，對兩組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較。

1.3.2 Ⅰ/Ⅱ期A1與A2組以及Ⅲ/Ⅳ期B1與B2組HER2陽性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較分析 采用edgeR軟件包對A1與A2組、B1與B2組轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進行差異基因分析。隨后對上調(diào)的部分差異基因(有統(tǒng)計學(xué)意義且變化倍數(shù)大于4)進行KEGG通路富集，分析兩組患者中主要的相關(guān)差異通路。

1.3.3 Ⅰ/Ⅱ期A1組與Ⅲ/Ⅳ期B1組患者上調(diào)差異基因交集分析 采用Venny在線網(wǎng)站分析A1組與B1組上調(diào)差異基因的交集基因，隨后進行KEGG通路富集，選擇與HER2密切相關(guān)的通路進行后續(xù)研究驗證。

1.3.4 驗證PI3K/AKT通路對HER2陽性乳腺癌患者OS的影響 為了驗證PI3K/AKT通路過度激活與HER2陽性乳腺癌患者OS的相關(guān)性，采用KMplot數(shù)據(jù)庫中HER2陽性乳腺癌患者的PI3K基因表達水平與OS數(shù)據(jù)進行分析。根據(jù)KMplot數(shù)據(jù)庫自動計算PI3K和AKT基因的界值(cut-off)，將患者分為高、低表達組，分別繪制不同表達組患者的Kplan-Meier曲線，觀察患者OS的差異。

1.3.5 PI3K抑制劑與HER2小分子抑制劑對HER2陽性乳腺癌細胞系生長抑制作用的相關(guān)性分析 為了驗證PI3K/AKT通路過度激活與HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥之間的相關(guān)性，采用2.5μmmol/L 拉帕替尼和2.5μmmol/L PI3K抑制劑分別單獨或聯(lián)合處理HER2陽性乳腺癌細胞系BT474，觀察藥物對細胞的生長抑制作用。

1.3.6 可能影響抗HER2治療耐藥的PI3K/AKT通路的其他基因分析 除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點基因外，該通路其他基因也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。通過KMplot數(shù)據(jù)庫對A1組和B1組上調(diào)差異基因的交集基因進行分析，尋找與HER2陽性乳腺癌患者OS相關(guān)且位于PI3K/AKT通路上的其他基因。

1.4 數(shù)據(jù)來源和統(tǒng)計學(xué)處理 PI3K、AKT、CFAP221和COL4A6表達水平與HER2陽性乳腺癌患者總生存時間差異的相關(guān)分析數(shù)據(jù)來自KMplot數(shù)據(jù)庫，采用Kaplan-Meier法繪制患者OS曲線并應(yīng)用log-rank檢驗進行兩組間比較。其余HER2陽性乳腺癌患者生存及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來自TCGA數(shù)據(jù)庫，差異基因分析利用edgeR軟件包完成計算，差異基因KEGG通路富集通過DAVID數(shù)據(jù)庫完成，差異基因的交集基因分析通過在線網(wǎng)站Venny完成，其余數(shù)據(jù)處理均通過GraphPad完成。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料呈正態(tài)分布的情況下以±s表示，細胞指數(shù)間的差異采用兩因素設(shè)計的方差分析進行比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HER2陽性乳腺癌患者OS情況 在181例HER2陽性乳腺癌患者中，OS最長可超過8.5年，尤其是128例Ⅰ/Ⅱ期的患者，其OS>8.5年者超過60%(圖1)，但其中4例OS<2年。53例Ⅲ/Ⅳ期患者的OS相對較短，但有4例OS大于7年。據(jù)此本研究將Ⅰ/Ⅱ期OS<2年者定義為A1組(n=4)，將>8.5年者定義為A2組(n=4)，后續(xù)研究將兩組患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較；同時將Ⅲ/Ⅳ期患者中OS<2年(B1組，n=4)與>7年(B2組，n=4)的患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較。

圖1 各分期HER2陽性乳腺癌患者的OSFig.1 Overall survival (OS) of patients with HER2-positive breast cancer in each stage

2.2 A1和A2組HER2陽性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較結(jié)果 利用edgeR軟件包對兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異基因分析，結(jié)果可見差異基因共2069個(P<0.05)，其中A1組比A2組表達上調(diào)的差異基因共697個，表達下調(diào)的差異基因共1372個(圖2A)。由于小分子抑制劑和抗體類藥物在HER2陽性乳腺癌患者治療中應(yīng)用更為廣泛，所以本研究更關(guān)注上調(diào)的部分差異基因，因此對差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)且變化倍數(shù)大于4的529個上調(diào)差異基因進行KEGG通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A1組患者表達上調(diào)的基因KEGG富集到的通路排在前10位的分別是：代謝通路、神經(jīng)活性配體受體互作通路、癌癥通路、趨化因子信號通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、細胞因子受體互作通路、干細胞多能性調(diào)節(jié)通路、Wnt信號通路、PI3K/AKT信號通路和谷氨酸能突觸通路(圖2B)。

2.3 B1和B2組HER2陽性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較結(jié)果 利用edgeR軟件包對兩組患者的轉(zhuǎn)錄組差異基因進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因共2039個，其中B1組比B2組表達上調(diào)的差異基因共1023個(P<0.05)，表達下調(diào)的差異基因共1016個(P<0.05，圖3A)。將B1組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)且變化倍數(shù)超過4倍的705個上調(diào)差異基因進行KEGG通路富集，結(jié)果表明B1組患者表達上調(diào)的基因KEGG富集得到的前3位通路分別是代謝通路、PI3K/AKT通路和神經(jīng)活性配體受體互作通路(圖3B)，這3個通路均是A1組上調(diào)差異基因富集到的通路。

圖2 A1與A2組患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Fig.2 Transcriptome data of patients in groups A1 and A2

圖3 B1與B2組患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Fig.3 Transcriptome data of patients in groups B1 and B2

2.4 A1組與B1組患者上調(diào)差異基因交集分析結(jié)果A1與B1組的上調(diào)差異基因共120個交集基因(圖4A)，將這些交集基因進行KEGG通路富集后發(fā)現(xiàn)兩組富集到的相同通路包括PI3K/AKT通路和代謝通路(圖4B)，這兩條通路并列第一位。雖然在這兩條通路中富集到的基因數(shù)相同，但由于PI3K/AKT通路是HER2的下游通路，因此我們認為PI3K/AKT通路的過度激活與HER2陽性乳腺癌患者OS相關(guān)。此外，由于富集到的代謝通路涉及類固醇生物合成等多條通路，明確其中與HER2陽性乳腺癌患者OS相關(guān)的具體通路需要更加深入的分析，因此在本研究中僅選擇PI3K/AKT通路作為候選通路進行重點驗證。

圖4 A1組上調(diào)差異基因與B1組上調(diào)差異基因的交集基因分析Fig.4 Overlapping genes analysis of up-regulated differential genes in groups A1 and B1

2.5 PI3K/AKT通路與HER2陽性乳腺癌患者OS的相關(guān)性驗證結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PI3K和AKT低表達者比較，高表達患者的OS更短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025，圖5A；P=0.0063，圖5B)。

2.6 PI3K抑制劑與HER2小分子抑制劑對HER2陽性乳腺癌細胞系BT474生長抑制作用的相關(guān)性驗證結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑能夠增強拉帕替尼對BT474的生長抑制作用(P=0.019，圖6)。

圖5 PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點PI3K和AKT基因高、低表達患者OS的Kplan-Meier曲線Fig.5 Kplan-Meier curve of OS in patients with high and low expressions of PI3K(A) and AKT(B)

圖6 PI3K抑制劑與拉帕替尼對BT474細胞生長抑制作用的相關(guān)性驗證結(jié)果Fig.6 The correlation between PI3K inhibitors and growth inhibitory effect of lapatinib on BT474 cells

2.7 可能影響抗HER2治療耐藥的PI3K/AKT通路其他基因分析結(jié)果 A1組與B1組患者共有120個上調(diào)的交集基因，其中19個基因高表達患者的OS明顯短于低表達患者(P<0.05)。其中CFAP221基因(P=0.00097，圖7A)可能是PI3K/AKT通路中基因之一。此外，這19個基因中還包括KEGG通路富集到的PI3K/AKT通路基因COL4A6，其高表達患者OS也短于低表達患者(P=0.037，圖7B)。

圖7 PI3K/AKT通路CFAP221(A)和COL4A6(B)基因不同表達水平患者OS的Kplan-Meier曲線Fig.7 Kplan-Meier curve of OS in patients with different expression levels of CFAP221(A) and COL4A6 (B) in the PI3K/AKT pathway

3 討 論

HER2陽性乳腺癌患者首選抗HER2治療，常用的抗HER2治療藥物包括單克隆抗體，如曲妥珠單抗(商品名赫賽汀)[10]，以及一些小分子抑制劑如拉帕替尼[11]。雖然超過40%的HER2陽性乳腺癌患者均受益于抗HER2治療[12]，但仍有不少患者對抗HER2治療耐藥，既包括原發(fā)性耐藥，也包括繼發(fā)性耐藥[13]。抗HER2治療耐藥的發(fā)生增加了HER2陽性乳腺癌患者死亡和復(fù)發(fā)的風險[14]，是造成患者OS短的主要原因之一[7]。關(guān)于抗HER2治療耐藥的機制已有一些報道：HER2自身的改變會導(dǎo)致抗HER2治療耐藥，如HER2失活突變，HER2 L755S突變引起的HER2失活會導(dǎo)致HER2小分子抑制劑拉帕替尼耐藥[15]；細胞表面黏蛋白如MUC4高表達會形成空間位阻從而阻止赫賽汀與HER2的特異性結(jié)合，導(dǎo)致赫賽汀耐藥[16]。免疫相關(guān)調(diào)控也會影響抗HER2治療耐藥的發(fā)生，HER2陽性乳腺癌細胞內(nèi)神經(jīng)介素U(NmU)高表達會提高免疫抑制分子轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和程序性死亡配體L1(PD-L1)的表達水平，從而通過增加免疫逃逸而引發(fā)耐藥[17]。盡管如此，有關(guān)HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療的耐藥機制仍然不是很清楚。

本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中181例HER2陽性乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組及生存數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在Ⅰ/Ⅱ期患者中，與A2組患者相比，A1組明顯上調(diào)的基因經(jīng)KEGG通路富集分析后，HER2下游通路PI3K/AKT被富集于第9位；在Ⅲ/Ⅳ期患者中，與B2組患者相比，B1組明顯上調(diào)的基因經(jīng)KEGG通路富集分析后，PI3K/AKT通路被富集于第2位。將A1組與B1組明顯上調(diào)的120個交集基因進行KEGG通路富集后，PI3K/AKT通路被富集在第1位。該結(jié)果提示HER2下游通路PI3K/AKT過度激活與HER2陽性乳腺癌患者OS短相關(guān)。通過KMplot數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路的2個關(guān)鍵節(jié)點基因PI3K和AKT高表達的HER2陽性乳腺癌患者OS均短于低表達患者，這進一步說明PI3K/AKT通路過度激活與患者生存期短相關(guān)。為闡明PI3K/AKT通路過度激活是否會影響HER2陽性乳腺癌細胞對抗HER2藥物治療的敏感性，本研究通過體外實驗證實PI3K抑制劑能夠增強HER2小分子抑制劑對細胞的生長抑制作用，說明PI3K/AKT通路過度激活有可能與HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥有關(guān)。

關(guān)于PI3K/AKT通路過度激活引發(fā)抗HER2治療耐藥的機制研究已有一些報道。陳曦等[18]通過體外誘導(dǎo)獲得赫賽汀耐藥細胞株，證實赫賽汀耐藥株中PI3K/AKT通路過度激活，在抑制PI3K活性后，細胞對赫賽汀再次變得敏感。Wang等[19]提出PI3K/AKT通路過度激活是導(dǎo)致拉帕替尼耐藥的機制之一。但是這些研究均為體外實驗或小樣本研究結(jié)果，缺乏大樣本研究支持。本研究利用TCGA中的大樣本人群數(shù)據(jù)為這一結(jié)論提供了理論支持。

通過KMplot數(shù)據(jù)庫對A1組與B1組上調(diào)差異基因的120個交集基因的基因表達水平與OS之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點基因之外，PI3K/AKT通路基因CFAP221或COL4A6高表達的HER2陽性乳腺癌患者OS也短于低表達患者，因此推測這兩個基因也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。CFAP221基因全稱是纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白221，與該基因相關(guān)的研究報道還不是很多，但已有研究證實該基因與鈣調(diào)蛋白具備相互作用[20]。 而對于鈣調(diào)蛋白與腫瘤之間的相關(guān)性已有不少報道，如Wang等[21]證實在肝臟中鈣調(diào)蛋白可激活PI3K/AKT通路，從而促進腫瘤的發(fā)生和進展。根據(jù)本研究的分析結(jié)果及文獻報道[22]，PI3K/AKT通路上的另一個基因COL4A6高表達同樣會縮短HER2陽性乳腺癌患者的OS。因此，PI3K/AKT通路基因CFAP221和COL4A6也可能與HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥相關(guān)。

本研究通過TCGA大數(shù)據(jù)分析證實PI3K/AKT通路過度激活與HER2陽性乳腺癌患者OS及抗HER2治療耐藥相關(guān)，提出對抗HER2治療耐藥的HER2陽性乳腺癌患者可嘗試PI3K抑制劑聯(lián)合治療的設(shè)想。除PI3K/AKT通路關(guān)鍵節(jié)點基因之外，該通路其他基因CFAP221和COL4A6也可能與抗HER2治療耐藥相關(guān)。本研究結(jié)果為HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥機制的研究提供了大樣本數(shù)據(jù)分析支持，同時為抗HER2治療耐藥的HER2陽性乳腺癌患者的治療提供了新的可借鑒的參考。

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