高效液相色譜法測(cè)定小兒化毒膠囊人工牛黃中膽紅素含量

趙珊珊 ，羅定強(qiáng) ，吳 芳 ，劉海靜 ，△

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061）

小兒化毒膠囊由人工牛黃、珍珠、雄黃、大黃、黃連、甘草、天花粉、川貝母、赤芍、乳香（制）、沒(méi)藥（制）、冰片 12 味中藥組方，具有清熱解毒、活血消腫的功效。該藥為西安碑林藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)(第50冊(cè))》，處方中原使用牛黃，2013年向國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局備案藥品注冊(cè)補(bǔ)充申請(qǐng)，使用人工牛黃代替牛黃投料。處方中的人工牛黃由膽酸、牛膽粉、豬去氧膽酸、膽紅素、牛磺酸、膽固醇、微量元素等加工制成，具有清熱解毒、化痰定驚的作用[1]。膽紅素為人工牛黃的主要成分之一，可在機(jī)體中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[2－3]，是人工牛黃發(fā)揮藥效的重要成分。因其在空氣中尤其光照下極易氧化，在提取過(guò)程中又易受影響而衰減[4]，故應(yīng)建立合理、有效的測(cè)定方法來(lái)控制其膽紅素的含量。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定小兒化毒膠囊人工牛黃中膽紅素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（含Empower色譜工作站，美國(guó)沃特斯公司）；BS224S型及BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

膽紅素對(duì)照品（批號(hào)為 100077－200805，純度以98.5%計(jì)），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（批號(hào)為 0000170700）、甲醇（批號(hào)為 0000170699）均為色譜純，購(gòu)自北京化標(biāo)源科技有限公司；冰醋酸（批號(hào)為20150804）、三氯甲烷（批號(hào)為 20170321）、甲醇（批號(hào)為20171027）均為分析純，鹽酸（批號(hào)為20140711）為優(yōu)級(jí)純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小兒化毒膠囊（西安碑林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為10011，10021，10031，10041，10051，10061，20071，20081）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －乙腈 －1% 冰醋酸（88 ∶1 ∶2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：452 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，膽紅素可達(dá)到基線分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

供試品溶液：取本品內(nèi)容物3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90∶10 ∶0.015 ∶0.3）25 mL，稱定質(zhì)量，冷水超聲處理（250 W，40 kHz）50 min，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90 ∶10 ∶0.015 ∶0.3）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液：取膽紅素對(duì)照品4.88 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶，加三氯甲烷適量使溶解，再稀釋至刻度。精密量取5 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加三氯甲烷 －甲醇 －鹽酸 －水（90∶10∶0.015∶0.3）混合溶液至刻度，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取缺人工牛黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為19.23 μg/mL的膽紅素對(duì)照品溶液 1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0 μL，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 808.047 X－4 734.624，r＝0.999 9(n＝7)。結(jié)果表明，膽紅素進(jìn)樣量在 0.019 23 ～0.288 45 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.16%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液 10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于制備0，4，8，12 h時(shí)進(jìn)行色譜測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為2.03%(n＝4)，表明供試品溶液僅在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，故溶液測(cè)定需要臨用時(shí)新制。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批次樣品6份，每份3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果膽紅素含量的RSD為2.30%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取膽紅素對(duì)照品6.15 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加溶劑制成質(zhì)量濃度為60.58 μg/mL 的溶液，作為貯備液；取已知含量的樣品（膽紅素含量為 0.084 mg /g）6 份，各 1.5 g，分別加入貯備液 1，1，1，2，2，2 mL，同法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 膽紅素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.4 樣品含量測(cè)定

對(duì) 8 批樣品(批號(hào)分別為 10011，10021，10031，10041，10051，10061，20071，20081)按已確定的試驗(yàn)方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果每粒樣品中膽紅素的含量分別為22.49，14.04，16.12，13.24，27.09，15.56，26.39，26.16μg。

3 討論

3.1 溶液穩(wěn)定性

膽紅素見(jiàn)光易分解且不穩(wěn)定，故溶液制備過(guò)程應(yīng)避光，臨用時(shí)新制。在進(jìn)行溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)時(shí)，測(cè)定了制備液每隔2 h的峰面積響應(yīng)值，結(jié)果顯示，膽紅素峰面積響應(yīng)值逐漸降低，收集峰面積響應(yīng)值的 RSD在4 h內(nèi)為2.0%，8 h內(nèi)為3.9%，12 h內(nèi)為 5.3%，測(cè)定值在 4 h時(shí)降低 3.8%，8 h時(shí)降低8.6%，12 h時(shí)降低12.3%。故溶液制備好后應(yīng)在4 h內(nèi)完成測(cè)定。

3.2 提取溶劑

本研究中分別用二氯甲烷、水飽和二氯甲烷、三氯甲烷、三氯甲烷 －甲醇 －鹽酸 －水（90∶10∶0.015 ∶0.3）、二氯甲烷 －甲醇 －10% 草酸（100 ∶10 ∶0.1）5 種溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90∶10 ∶0.015 ∶0.3）作為提取溶液時(shí)測(cè)定值最高。

3.3 方法優(yōu)越性

2015年版《中國(guó)藥典(一部)》人工牛黃項(xiàng)下膽紅素的測(cè)定方法為紫外－可見(jiàn)分光光度法，以三氯甲烷作溶劑提取，提取不完全，且測(cè)定時(shí)易被空氣氧化，方法專屬性較差，存在一定局限性。薄層色譜掃描法用于人工培植牛黃和天然牛黃中膽紅素的定量分析也有報(bào)道，該方法專屬性和重復(fù)性均欠佳，不能保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確[5－6]。另外，還有研究通過(guò)差示分光光度法測(cè)定中成藥中膽紅素的含量[7]，以及通過(guò)間接光度法和流動(dòng)注射分光光度法測(cè)定人工牛黃中膽紅素的含量[8－9]，此2種方法因顯色及試驗(yàn)條件局限，均未得到廣泛應(yīng)用。而HPLC法因其方法簡(jiǎn)便、高效，測(cè)定結(jié)果精確可靠等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛認(rèn)可，已成為檢測(cè)牛黃及其替代品中膽紅素的首選方法[10－14]。

3.4 方法合理性

人工牛黃藥材由各種原料按照一定比例配置而成，本次試驗(yàn)中收集到的6批不同產(chǎn)地的人工牛黃中膽紅素含量介于0.607% ～0.784%。有文獻(xiàn)報(bào)道，以氯仿－冰醋酸（4∶1）為提取溶劑超聲提取，測(cè)得人工牛黃中膽紅素的含量介于 0.71% ～0.78%[15]；以二甲基亞砜超聲提取，測(cè)得人工牛黃中膽紅素的含量為0.472%[16]。故各結(jié)果基本相符。

3.5 轉(zhuǎn)移率及含量范圍

2015年版《中國(guó)藥典(一部)》要求人工牛黃中膽紅素的含量不得低于0.63%，按此含量及處方量計(jì)算，每粒小兒化毒膠囊應(yīng)含有膽紅素 29.99 μg。批號(hào)為2016124的小兒化毒膠囊人工牛黃含量為0.607%，按此含量及處方量計(jì)算每粒膠囊含有膽紅素28.89 μg。以其為原料制成的3批樣品的含量分別為每粒26.16，26.39，27.09 μg，按每粒裝量為 0.3 g 計(jì)算，轉(zhuǎn)移率分別為 90.6% ，91.3% ，93.8% 。按 70% 轉(zhuǎn)移率計(jì)算，每粒含量為20.2 μg。參考以上測(cè)定結(jié)果、生產(chǎn)工藝及批間差異，擬規(guī)定小兒化毒顆粒每粒含人工牛黃以膽紅素（C33H36N4O6）計(jì)，不得少于 18 μg。

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