Cd2+暴露對斑馬魚肝臟和卵巢抗氧化和免疫系統的影響及藍LED光預暴露的保護作用

蔡榮, 郭賽男, 鄭家浪

浙江海洋大學 海洋科學學院，舟山 316000

鎘(Cd)是非必需金屬元素，即使很低劑量也能對人類和動物產生巨大的毒性[1]。在正常的淡水中，Cd2+的濃度介于10到500 ng·L-1之間[2]，然而，在我國的灤河流域Cd2+的濃度為1.120～4.474 μg·L-1 [3]，在武漢東湖西南湖區為8 μg·L-1[4]，在龍江重污染河段甚至達到800 μg·L-1[5]。目前，Cd已經成為局部水生生態系統的主要污染源。

Cd主要通過誘導氧化應激和免疫毒性對魚類產生廣泛的毒性影響[4]。因此，搜尋一種合適的抗氧化劑或者免疫增強劑以提高魚類對金屬的耐受性成為目前研究的熱點。例如，水體中加入腐殖酸或者飼料添加肌醇可以明顯增強魚類抗氧化和免疫能力，緩解金屬暴露誘導的損傷[7-8]。發光二極管(LED)具有能耗低、發出光單色性高和壽命長等優點。盧菁菁和李敦海[9]的研究表明，不同光質LED能影響念珠藻葛仙米生長并對生理生化產生顯著影響。Villamizar等[10]暗示藍LED光 (LDB) 能促進鱸魚的生長和發育。其他的一些有關魚類的研究證明，LDB能緩解饑餓或者高溫誘導的氧化應激[11-12]。但是，到目前為止，沒有任何研究報道LDB預暴露對隨后金屬暴露的正面影響。最近我們課題組的幾項研究表明，藍LEDs(LDB)不僅能促進魚類的生長發育，而且能增強免疫力和緩解氧化應激[13-15]。因此，當前研究的假設是LDB預暴露可以緩解Cd暴露引起的氧化性損傷和免疫毒性。

魚類依賴抗氧化防御系統和先天免疫系統應對環境威脅。在抗氧化系統中，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是其重要指標。在免疫系統中，環氧合酶-2 (COX-2)和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)都是炎癥過程中的早期反應基因。一方面，這些基因受轉錄因子控制。例如，核轉錄相關因子2(Nrf2)和核轉錄因子-κB(NF-κB)調控著相關基因的轉錄，在金屬誘導的氧化應激和免疫毒性過程中起著至關重要的作用[6, 16]。另一方面，這些轉錄因子又受其抑制子調節。抑制因子Kelch樣ECH聯合蛋白1(Keap1)和抑制蛋白激酶(IκBα)分別結合Nrf2 和 NF-κB，使其處于失活狀態。當機體處于應激狀態，Keap1和IκBα磷酸化導致抑制子從轉錄因子解離，進而誘導Nrf2和NF-κB的轉錄激活。本研究以斑馬魚為研究模型，分析急性Cd暴露對斑馬魚抗氧化系統和免疫反應的影響，評估藍LEDs (LDB)預暴露可能的緩解作用，探討可能的分子機制，為處理金屬毒性提供策略措施，為魚類健康養殖提供理論依據。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　實驗設計

AB系斑馬魚于室內預暴露2周。相同規格的斑馬魚(初始體重(0.19 ± 0.02) g, mean ± SEM)為2組，分別用白熾燈和LDB處理4周 (輻照度為0.9 W·m-2)。4周后每組再分為2個小組，分別在白熾燈下用0和0.97 mg·L-1Cd2+的水體處理4 d。共有4個處理，每個處理4個重復，每個重復80尾魚，包括(1) 正常對照組；(2) Cd處理組：單獨0.97 mg·L-1Cd2+暴露組；(3)LDB預處理組；(4) LDB預處理+Cd暴露組。Cd濃度和輻照度的設定參照我們近期的研究[6, 14]。試驗期間每天早上7點換水100%，隨后加入Cd的母液到理論濃度。斑馬魚每天按照體重的1%投喂量分別在早上8點、下午3點和晚上9點投喂。試驗期間定期檢測水質：水溫(25.8 ± 0.4) ℃，光周期12 h L:12 h D，溶解氧(7.46 ± 0.34) mg·L-1，pH值7.49 ± 0.17。對照組的Cd濃度為0，Cd處理組水體Cd濃度為(0.97 ± 0.04) mg·L-1。采用火焰原子吸收光譜法(FAAS)測量金屬濃度。

1.2　樣品采集和勻漿液準備

取樣之前，魚禁食24 h，然后使用0.02%的MS-222麻醉。隨機取魚在冰袋上進行肝臟和卵巢樣本采集。樣本采集后立即放入凍存管中，然后用液氮速凍，最后置-80 ℃冰箱保存備用。

肝臟和卵巢組織用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 7.4)在玻璃勻漿器中冰浴勻漿。勻漿液離心(20 min、5 000 r·min-1、4 ℃)后取上清液，立即進行相關指標的測定。

1.3　抗氧化和免疫指標測定

采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定Cu/Zn-SOD的活力；采用可見光分光光度計法測定CAT活力；采用精氨酸轉化法測定iNOS活性；采用放射免疫法測定COX-2活性[17]；采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量；采用硝酸還原酶法測定NO含量；采用考馬斯亮蘭法測定樣品總蛋白。除COX-2外所有指標的測定采用南京建成試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行。實驗采用4次生物學重復和2次技術性重復。

1.4　基因表達測定

組織總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成參照我們最近的研究[16]。采用Applied Biosystems Prism 7500實時定量PCR儀，參照SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara) 試劑盒說明書進行qRT-PCR。引物序列詳見表1。每對引物經瓊脂糖凝膠電泳檢測只有單一條帶，不同的引物在擴增效率上沒有顯著差異。以β-Actin和GAPDH幾何平均數作為相對定量內參[16]，采用2-ΔΔCt法分析數據，計算目的基因的相對表達量。

1.5　統計分析

本實驗數據采用SPSS 19 統計分析軟件進行方差分析和Duncan多重比較。數據進一步統計檢驗前用單樣本Kolmogorov Smirnow檢驗和Levene方差齊次性檢驗分別確定其分布型和方差同質性。數據以平均值±標準差表示，顯著度水平為0.05。

2　結果(Results)

2.1　LDB預暴露對Cd2+暴露斑馬魚MDA和NO含量的影響

與對照組相比，急性Cd2+暴露組MDA和NO的含量在肝臟和卵巢中顯著升高(P < 0.05) (圖1)。LDB預暴露組MDA和NO的含量在肝臟和卵巢中沒有顯著變化(P > 0.05)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組中，MDA和NO的含量在卵巢中沒有顯著變化(P > 0.05)，在肝臟中仍處于較高的水平(P < 0.05)。

2.2　抗氧化反應

與對照組相比，急性Cd2+暴露導致了肝臟Cu/Zn-SOD和CAT的酶活和表達的顯著下降 (P < 0.05) (圖2)。Cd2+暴露也導致卵巢CAT的酶活和表達以及Cu/Zn-SOD的表達顯著上升(P < 0.05)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組中，Cu/Zn-SOD和CAT在肝臟中的表達水平以及在卵巢中的表達和活性水平維持在正常水平(P > 0.05)，并且在肝臟中的酶活顯著上升(P < 0.05)。除了能誘導肝臟CAT的表達升高外(P < 0.05)，LDB預暴露不能顯著影響以上指標(P > 0.05)。

2.3　炎癥反應

與對照組相比，急性Cd2+暴露導致了肝臟COX-2和iNOS的酶活和表達的顯著上升 (P < 0.05)，也導致卵巢COX-2和iNOS的酶活顯著上升(P < 0.05)，但并不顯著影響卵巢COX-2和iNOS的表達(P > 0.05) (圖2)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組的肝臟中，COX-2和iNOS的表達恢復到對照水平(P > 0.05)，但是COX-2和iNOS的酶活仍顯著上升(P < 0.05)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組的卵巢中，COX-2和iNOS的酶活恢復到對照水平(P > 0.05)，但是COX-2的表達水平仍較高(P < 0.05)。除了能誘導肝臟COX-2的表達下降外(P < 0.05)，LDB預暴露不能顯著影響以上指標(P > 0.05)。

2.4　轉錄因子及其抑制因子的表達

與對照組相比，急性Cd2+暴露組肝臟中Nrf2、Keap1a、Keap1b、NF-κB和IκBαa的表達水平顯著上升(圖4A) (P < 0.05)。在Cd2+暴露組卵巢中Nrf2和NF-κB的表達增加，Keap1a和IκBαa的表達減少(圖4B)(P < 0.05)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組的肝臟中Nrf2、Keap1a、Keap1b、NF-κB和IκBαa的表達恢復到正常水平(P > 0.05)，IκBαa的表達水平顯著增加(P < 0.05)。在LDB預暴露+Cd2+暴露組的卵巢中Nrf2、Keap1a和NF-κB的表達恢復到正常水平(P > 0.05)，Keap1b和IκBαa的表達水平顯著增加(P < 0.05)。除減少肝臟NF-κB的表達和增加IκBαa的表達以及增加卵巢IκBαb的表達外(P < 0.05)，LDB預暴露不能顯著影響以上指標(P > 0.05)。

圖2　LDB預暴露對急性Cd2+暴露斑馬魚肝臟和卵巢抗氧化酶活性和表達的影響注: *與對照相比, P < 0.05。Fig. 2　Effects of LDB acclimation on mRNA levels and activity of antioxidant enzymes in liver and ovary of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

圖3　LDB預暴露對急性Cd2+暴露斑馬魚肝臟和卵巢免疫相關酶活性和表達的影響注: *與對照相比, P < 0.05。Fig. 3　Effects of LDB acclimation on mRNA levels and activity of enzymes related to immunity in liver and ovary of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

圖4　LDB預暴露對急性Cd2+暴露斑馬魚肝臟(A)和卵巢(B)轉錄因子及其抑制因子表達的影響注：*與對照相比，P < 0.05。Fig. 4　Effects of LDB acclimation on mRNA levels of transcription factors and their inhibitors in liver (A) and ovary (B) of zebrafish acutely exposed to Cd2+Note: * denotes significant differences (P<0.05) with control group.

2.5　轉錄因子與其目的基因及其抑制因子表達的相關性

如表2所示，Nrf2的表達與其目的基因Cu/Zn-SOD和CAT的表達在卵巢中呈現顯著的正相關性，但是在肝臟中呈現顯著的負相關性。Nrf2的表達與其抑制因子Keap1a和Keap1b的表達在肝臟中呈現顯著的正相關性。在肝臟中，NF-κB的表達與其目的基因iNOS和COX-2顯示顯著的正相關性，與IκBαb的表達呈現顯著的負相關。在卵巢中，NF-κB與IκBαa的表達呈現顯著的負相關。

3　討論(Discussion)

Cd主要通過氧化應激和炎癥反應對機體產生損傷。MDA是脂質過氧化的指標，反應了氧化應激誘導的細胞功能障礙[18-20]。NO作為魚類免疫系統的一個重要信號分子，能誘導炎癥反應并且在魚類免疫系統損傷和細胞凋亡中起著重要作用[21]。本研究中，Cd暴露顯著提高了斑馬魚肝臟和卵巢MDA和NO水平，表明Cd暴露導致了氧化性損傷和免疫毒性。該結果和我們近期的研究相符[6, 13, 16]。此外，我們的研究揭示了LDB預暴露具有緩解Cd毒性的作用。例如，在Cd暴露+ LDB預暴露組中，斑馬魚卵巢MDA和NO的含量恢復到正常水平。盡管在Cd暴露+ LDB預暴露組肝臟中MDA和NO含量相對于對照仍處于較高水平，但是絕大部分氧化應激和炎癥反應相關基因的表達恢復到正常水平。當前的研究結果表明：早期LDB暴露的斑馬魚在后期能更好地抵御外源刺激物誘導的氧化應激和免疫毒性。Bayarri等[22]的研究表明藍光能有效地誘導魚類松果體和視網膜褪黑素的產生。產生的褪黑素經由血液循環到達肝臟和卵巢，可能緩解應激的負面影響[23]。另一方面，LDB預暴露很有可能導致了細胞防御機制的提前動員使之能迅速地響應應激反應[24]。

金屬暴露會干擾線粒體的功能，產生更多的活性氧(ROS)，進而形成氧化應激[25]。生物體在進化過程中形成了抗氧化防御系統以抵御ROS的損傷。在抗氧化系統中，SOD是一種重要的抗氧化性酶類，能夠催化超氧陰離子發生歧化反應，解除超氧陰離子對細胞產生的毒害作用[26]。CAT是生物氧化中的末端氧化酶，能分解生物體某些代謝物需氧脫氫后所產生的對機體有害物質的一種酶，具有一定的解毒功能[27]。本研究中，卵巢Cu/Zn-SOD和CAT的表達以及CAT的活性在單獨Cd暴露條件下顯著上升，表明抗氧化系統被激活。相似地，斑馬魚胚胎在115 μg·L-1Cd的水體中暴露4 d，Cu/Zn-SOD和CAT的表達和Cu/Zn-SOD的活性增加[2]，在570 μg·L-1Cd的水體中暴露4 h，CAT的表達升高[28]。Wang等[29]研究顯示河豚在5 mg·L-1Cd的水體中暴露4 h，肝臟SOD活性增加。然而，抗氧化系統的激活可能并不足以清除過量的ROS，從而導致卵巢脂質過氧化水平顯著增加。過量的ROS會增加氧化性損傷風險，反過來降低肝臟抗氧化酶的活性[30]。在Cd暴露+LDB預暴露條件下，Cu/Zn-SOD和CAT在肝臟中的表達以及在卵巢中的活性和表達都恢復到正常水平，在肝臟中的酶活大幅增加。以上的結果表明，LDB預暴露有助于緩和Cd誘導的氧化應激。氧化還原的平衡是機體行使正常免疫反應的前提[31]。iNOS和COX-2是炎癥響應過程中的早期基因，被認為炎癥標記物。在炎癥反應模型中，iNOS和COX-2往往被協同誘導[32]。在Cd暴露組中，iNOS和COX-2在卵巢中的表達和酶活都顯著上升，表明了Cd引起了強烈的炎癥反應。LDB預暴露緩解了這些指標的過度增加，表明LDB預暴露具有抵抗Cd誘導的炎癥的作用。相反，在Cd暴露+LDB預暴露組的肝臟中，iNOS和COX-2的酶活相對于對照組仍處于較高水平，暗示LDB預暴露在肝臟中并沒有緩解炎癥的作用。然而，我們注意到的是，LDB預暴露導致Cd誘導的iNOS和COX-2的表達恢復到正常水平。我們猜想從mRNA水平到蛋白質或者活性水平，存在一個時間效應。這可能導致盡管iNOS和COX-2的mRNA水平不變，但是它們的活性仍處于較高水平。

表2　轉錄因子與其目的基因及其抑制因子之間的相關性分析Table 2　Correlation coefficients between mRNA levels of transcription factors and their target genes and inhibitors

Cd的毒性和ROS的大量聚集有關。在Cd暴露組中，組織過高的脂質過氧化水平反映了大量ROS的形成。相應地，ROS含量的增加能通過ROS/Nrf2和ROS/NF-κB信號通路分別激活抗氧化和炎癥反應[33-34]。在Cd暴露+LDB預暴露條件下，斑馬魚肝臟和卵巢中Nrf-2和NF-κB的表達水平恢復到正常水平，表明LDB預暴露對Cd誘導的炎癥反應具有改善作用。在這過程中，卵巢Keap1b和IkBαa和肝臟IkBαa的表達水平升高。這將有助于形成反饋抑制從而控制Nrf2和NF-κB的豐度[35]。Nrf-2結合抗氧化基因的啟動子區的ARE序列來激活下游基因轉錄[36]。NF-κB調控大量炎癥反應相關基因的表達[37]。相應地，卵巢Nrf-2與其目的基因(Cu/Zn-SOD和CAT)，肝臟NF-κB與其目的基因(iNOS和COX-2)均顯著正相關。然而，我們也可以注意到，肝臟Nrf-2與其目的基因，卵巢NF-κB與其目的基因沒有顯著的相關性。這可能涉及組織特異性的調節機制。也有可能Nrf2或者NF-κB的蛋白活性而不是它們的轉錄水平決定了下游基因的誘導表達。在后續的研究過程中，我們將進一步驗證我們的假設。

總之，當前的研究結果表明，急性Cd暴露誘導了斑馬魚肝臟和卵巢氧化應激和免疫毒性，而LDB預暴露可以起到緩解作用。這個過程可能涉及Nrf2和NF-κB信號通路及其誘導的下游基因表達和相關酶的活性。當前的研究將為處理環境因子導致魚類的毒性提供新的預防措施，為促進魚類的健康養殖提供新的思路和理論依據。

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