麻花艽×狹葉柴胡F1代β-amyrin合成酶基因表達及齊墩果酸含量分析

劉艷玲， 向鳳寧

(1.萊蕪職業技術學院信息工程系，山東 萊蕪 271100；2.山東大學生命科學院 植物細胞工程與種質創新教育部重點實驗室，山東 濟南 250100)

【研究意義】中藥材的絕大多數有效成分都來源于次生代謝產物，隨著對植物次生代謝網絡認識和研究的不斷深入，應用細胞融合方式向目標植物中導入可表達的基因序列或者完整的生物合成途徑已成為可能，并逐漸發展為具有廣闊應用前景的熱點研究領域[1-4]。高寒藏藥材—麻花艽(GentianastromineaMaxim.)系龍膽科、龍膽屬植物，分布于青海、西藏、甘肅等海拔2500～4700 m 的高寒地區，全草及根入藥，其主要有效成分為齊墩果酸、龍膽苦甙等，主治風濕性關節痛、黃膽性肝炎、膽結石等病[5-7]。狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)為傘形科、柴胡屬植物，主要用于治療感冒發熱、胸肋腹痛等癥，是著名的抗病毒感冒中藥材[8]。【前人研究進展】利用細胞融合手段可以將代謝途徑中的關鍵酶基因進行轉移，從而改變目標產物的含量。Yun等在顛茄(Atropabelladonna)中引入編碼莨菪堿-6β-羥化酶的基因，結果使顛茄中含量很低的高價值托品生物堿東莨菪堿大量積累，并且幾乎所有的莨菪堿都轉化成了東莨菪堿[9]；Shelagh等通過番茄CHI(chalcone isomerase)基因的超量表達使其果皮的類黃酮含量增加了78倍，其加工產品番茄醬中的類黃酮含量增加了21倍[10]。Shim等在人參中過量表達SQS基因，測得轉基因植物中人參皂甙的含量為對照的2.5倍[11]。【本研究切入點】本實驗室已經通過細胞融合的方式獲得了麻花艽和狹葉柴胡的雜種細胞系[12]，并已經在親本中克隆了齊墩果酸合成的關鍵酶β-amyrin合成酶的基因序列[13]，分析了該基因在雜種細胞系中的表達方式，確定雜種細胞系中基因的變異與齊墩果酸含量的關系。【擬解決的關鍵問題】以期為深入研究中草藥次生代謝奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

麻花艽、狹葉柴胡、雜種細胞系ZA、ZB、ZC。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因擴增 ①引物。GsAS1正向引物P1：5′-GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3′；GsAS1反向引物P2：5′-CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3′；GsAS2正向引物P3：5′-CTCGAGATGTGGAGGCTGAAGATCG-3′；GsAS2反向引物P4：5′-CTCGAGCGTCTCTCAAATCTTCAAGATGGCAA-3′。② 擴增體系。采用20 μl PCR體系rTaq為大連Takara生產。反應體系如下：10×PCR Buffer 2.0 μl(1×)；MgCl2(25 mM)1.2 μl(1.5 mM)；dNTP(10 mM)0.2 μl(200 μM)；引物 各40 pmol；rTaq酶(5 U/μl)0.1 μl(0.5 U)；模板 50～200 ng；加水至20 μl；③擴增程序。按照以下循環進行擴增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 2.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

1.2.2 β-amyrin合成酶基因的半定量RT-PCR 正向引物：5′-CCACCG(A)TTTTTG(A)CTCTGTA-3′；反向引物：5′-ACTTGGCTTTCGATA(T)CTTGG-3′；Tm：49 ℃。

1.2.3 測序 博尚生物公司。

1.2.4 序列比對 應用DNAMAN軟件進行。

1.2.5 HPLC 儀器為日本島津公司生產的LC-10AD型高效液相色譜儀，齊墩果酸標準品從中國藥品生物制品檢定所購買。分別取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μl 齊墩果酸標準品進樣，以峰面積值為橫坐標，進樣量為縱坐標作圖，得回歸方程為：y=0.00287888x-16.1335，r=0.9994724，表明儀器精密度良好。

2 結果與分析

2.1 雜種細胞系中β-amyrin合成酶基因的克隆與序列分析

2.1.1 雜種細胞系中β-amyrin合成酶基因的克隆 在先前的研究中，已經通過RACE方法在麻花艽中獲得了 2 個同源的β-amyrin合成酶基因，將其稱作GsAS1 和GsAS2；在狹葉柴胡中獲得了 1 個 β-amyrin合成酶基因，稱作BsAS。本研究以P1、P2和P3、P4 兩對引物分別在雜種細胞系ZA、ZB、ZC中進行擴增，分別獲得了GsAS1 的同源序列GsAS1za、GsAS1zb、GsAS1zc和GsAS2的同源序列GsAS2za、GsAS2zb、GsAS2zc(圖1a,b)，通過序列分析表明，這 6 個基因均編碼β-amyrin合成酶基因。在狹葉柴胡BsAS的多個區段中設計引物，對雜種細胞系進行擴增，均未獲得相應的片段，由此可以看出，雜種ZA、ZB、ZC僅表達了來源于供體麻花艽的GsAS1和GsAS2。

2.1.2 雜種細胞系中GsAS1和GsAS2的同源性比較 將雜種細胞系ZA、ZB、ZC中的6個基因序列GsAS1a、GsAS2a、GsAS1b、GsAS2b、GsAS1c、GsAS2zc進行分析，其核苷酸同源性為90.24 %，氨基酸序列同源性為90.38 %。其中，GsAS1與GsAS1a、GsAS1b、GsAS1c序列完全相同；GsAS2與GsAS2b序列完全相同，與GsAS2a、GsAS2c不相同，其核苷酸序列同源性分別為99.8 %和99.87 %，氨基酸序列同源性分別為99.87 %和99.80 %。

圖1 體細胞雜種cDNA中GsAS1(A)和GsAS2(B)基因的擴增Fig.1 Amplification of GsAS1(A)和GsAS2(B) from cDNA in hybrids

IMS: isomultiflorenol合成酶; BAS: β-amyrin 合成酶 (單功能型); MTS:多功能三萜合成酶; LUS:羽扇豆醇合成酶; OSC: 氧化角鯊烯合成酶; CAS: 環阿屯醇合成酶; MAS: 混合的β-amyrin 合成酶圖2 親本和雜種中β-amyrin合成酶基因的系統樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-amyrin synthase in parents and hybrids

2.2 體細胞雜種中β-amyrin合成酶基因的系統樹分析

為了分析體細胞雜種中β-amyrin合成酶基因與親本及其它物種中同族基因的親緣關系，從GenBank中選取了擬南芥、大豆、人參、甘草、白樺、紫菀、北柴胡等植物的β-amyrin合成酶基因、環阿屯醇合成酶基因、羽扇豆醇合成酶基因等氧化角鯊烯家族基因進行系統樹分析。結果表明：GsAS1及其3個雜種細胞系最接近擬南芥的LUP2(屬于羽扇豆醇合成酶)，在GsAS1所處的分支上，除剛才提到的LUP2外，其余均為βAS(β-amyrin合成酶)(圖2)，說明GsAS1及其雜種應聚類在β-amyrin合成酶中。GsAS2及其3個雜種細胞系均與人參的OSCPNY2(屬于β-amyrin合成酶)關系最近，而體細胞雜種的另一個親本狹葉柴胡的BSAS存在于系統樹的另一β-amyrin合成酶分支上，與綠玉樹最接近，與麻花艽親緣關系較遠。

2.3 雜種細胞系中GsAS1和GsAS2的等位變異研究

對親本及其雜種細胞系的β-amyrin合成酶基因序列進行分析，如圖3所示，雜種ZA和ZC的GsAS2 與麻花艽的GsAS2序列存在1～2個堿基的突變(同源性分別為99.3 %和98.6 %)，麻花艽GsAS2 第4位氨基酸(CTG)在雜種ZA和ZC中突變為CTA，但CTG和CTA均編碼亮氨酸；384位氨基酸CCA在雜種ZC中突變成CCG，但二者均編碼脯氨酸。這說明在雜種細胞系中，GsAS2a和GsAS2c雖發生了不同程度的堿基突變，卻編碼同一種氨基酸，即發生了無義突變，因此，不影響雜種ZA和ZC中GsAS2的功能。

2.4 雜種細胞系及親本β-amyrin合成酶基因表達及下游產物齊墩果酸含量分析

2.4.1 雜種細胞系及親本β-amyrin合成酶基因表達分析 利用β-amyrin合成酶基因對雜種ZA、ZB、ZC及親本進行RT-PCR分析，如圖4所示，雜種ZB和ZC均高于雙親，ZA低于雙親，且ZA低于ZB和ZC。

圖3 GsAS2基因在麻花艽及雜種中的核苷酸序列比較Fig.3 Comparison of nucleotides of GsAS2 in G. straminea and hybrids

圖4 親本及雜種β-amyrin合成酶基因的RT-PCR分析Fig.4 Expression of β-amyrin synthase gene in parents and hybrids by semi-quantitative RT-PCR

圖5 體細胞雜種及親本齊墩果酸的HPLC分析Fig.5 HPLC analysis of the oleanolic acid in parents and hybrids

2.4.2 雜種細胞系及親本齊墩果酸含量分析 齊墩果酸含量的HPLC分析表明，體細胞雜種ZA的齊墩果酸含量均低于雙親，ZB和ZC均高于雙親，其中，ZB的齊墩果酸含量最高，是麻花艽的 2.4 倍，其次是ZC，為麻花艽的1.8 倍(圖5)。綜合圖4～5可以看出，齊墩果酸含量和β-amyrin 合成酶基因的表達水平呈正相關，并且說明ZA和ZC中的堿基突變并沒有影響其下游產物齊墩果酸的含量，也就是說：β-amyrin合成酶中個別基因的突變對該基其功能未造成影響。

3 討 論

前人研究發現，體細胞雜交技術可以實現外源染色體/DNA片段及基因向受體基因組的轉移[14-16]。本研究通過分析β-amyrin合成酶基因在麻花艽與狹葉柴胡的3個雜種細胞系中的存在方式，發現雜種與麻花艽基因的序列相似性很高，僅在ZA中發生了1個堿基突變，在ZB中未發生突變，在ZC中發生了2個堿基突變。進一步分析發現，這些基因的變異與3個體細胞雜種的齊墩果酸含量沒有對應關系，表明，β-amyrin合成酶基因發生1～2個堿基的無義突變對該基因的功能沒有影響。

另外，在本實驗中，體細胞雜種中的β-amrin合成酶基因均來源于麻花艽，而未得到來源于柴胡的該基因。其原因可能與柴胡的β-amrin合成酶基因在其愈傷組織培養及體細胞雜交過程中發生了丟失，其丟失位點由麻花艽β-amyrin合成酶基因所替代有關，這還需要進行深入探討。

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