不同水平豌豆蛋白粉對高郵鴨生長及其相關激素與基因表達的影響

周根來，楊曉志，殷潔鑫，周明夏，左偉勇

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省現代畜牧與新獸藥工程技術中心，江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300)

【研究意義】作為我國重要的食用豆類之一，豌豆提取得到的淀粉、纖維和蛋白不僅可以作為食品工業原料，也可以用在紡織、醫藥、化工等領域[1-2]。豌豆蛋白粉是豌豆加工粉絲后的副產品之一，具有營養價值較高、價格較低、資源較豐富等優勢，可以作為非常規蛋白飼料部分替代魚粉、豆粕等原料，其開發利用已逐漸得到重視。【前人研究進展】如何合理利用豌豆蛋白粉需要廣泛深入的系統研究，但有關在豬、雞飼糧中的研究鮮見，也沒有在鴨飼糧中的研究報道。本團隊前期研究表明豌豆蛋白粉可應用于高郵鴨飼糧中，使用6 %豌豆蛋白粉代替部分豆粕未影響0～4周齡高郵鴨的主要養分消化率，有助于消化器官的發育，并促進體內蛋白質和脂肪代謝。但其促生長的深層機制還未研究。【本研究切入點】本試驗在0～4周齡高郵鴨飼糧中使用豌豆蛋白粉，研究其對鴨生長相關激素分泌及基因表達的影響。【擬解決的關鍵問題】為豌豆蛋白粉有效應用于鴨飼養實踐中提供理論機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及日糧

試驗選取160只1日齡體質健壯、體重接近的高郵鴨，隨機分為4組，每組4個重復，每個重復10只鴨，公母各半。對照組(C0組)飼喂基礎飼糧，參照NRC(1994)飼養標準以玉米—豆粕為基礎進行配制；試驗組(C1、C2、C3組)飼糧是在基礎飼糧的基礎上分別用3 %、6 %、9 %的豌豆蛋白粉代替豆粕配制而成，試驗飼糧組成及營養水平見表1。試驗期為28 d。試驗鴨自由采食、充足飲水，按正常飼養程序進行免疫接種、光照和飼喂。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(風干基礎)

注： 1)預混料為每千克飼糧提供: VA 15 000 IU，VD33200 IU，VE 12.5 IU，VK31.5 mg，VB14 mg，VB25 mg，VB62 mg，VB120.01 mg，生物素0.2 mg，葉酸0.5 mg，D-泛酸15 mg，煙酸65 mg，抗氧化劑100 mg，Fe (as ferrous sulfate) 86 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Zn (as zinc sulfate) 90 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg， I (as potassium iodide) 0.42 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。2)代謝能、氨基酸為計算值，其余為實測值。

Note: 1)The premix provided the following per kg of diets: VA 15 000 IU, VD33200 IU, VE 12.5 IU, VK31.5 mg, VB14 mg, VB25 mg, VB62 mg, VB120.01 mg, biotin 0.2 mg, folic acid 0.5 mg, D-pantothenic acid 15 mg, nicotinic acid 65 mg, antioxidant 100 mg, Fe (as ferrous sulfate) 86 mg, Cu (as copper sulfate) 8 mg, Zn (as zinc sulfate) 90 mg, Mn (as manganese sulfate) 80 mg, I (as potassium iodide) 0.42 mg, Se (as sodium selenite) 0.3 mg; 2) ME and AA were calculated values, while the others were measured values.

1.2 樣品采集與處理

血清樣品：28日齡時，每重復隨機選取2只鴨進行翅靜脈采血5 mL，靜置30 min，在3000 r/min低溫下離心10 min 取上清液裝至凍存管中，于-20 ℃冰箱中保存備用。

肌肉組織樣品：28日齡時，每重復隨機選取1只鴨進行屠宰采樣。試驗鴨放血致死后，迅速采集每只鴨的胸肌和腿肌組織樣本各1個，各肌肉組織樣品立即放入液氮中速凍，實驗室-70 ℃冰箱中保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長性能 在第1和28日齡時分別對各重復試驗鴨群體進行空腹稱重，用于計算各處理鴨的平均日增重ADG(g/d)。試驗期間，記錄每天每重復試驗鴨的飼糧飼喂量，每1周統計每重復的剩料量，計算各處理鴨的平均日采食量ADFI(g/d)。根據每重復試驗鴨的ADG和ADFI計算各處理鴨的料重比(F/G)。記錄鴨只死亡體重，以校正鴨只的耗料及其他指標。

1.3.2 血清激素水平測定 鴨血清樣品中生長激素(GH)、胰島素(Insulin)、胰島素樣生長因-1(IGF-1)和瘦素(Leptin)水平采用放射性免疫法測定，測定所用試劑盒購自上海滬宇生物科技有限公司。

1.3.3 引物設計與合成 根據NCBI公布的禽類GH1(101790997)、Insulin(101794427)、IGF-I(101793597)、Obese(AY555727.1)和β-actin(101800437)的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，引物序列見表2。

1.3.4 RNA提取與反轉錄 采用Trizol法提取鴨胸肌和腿肌組織中的總RNA。用分光光度計測定OD260/OD280的比值以檢測RNA的純度，再用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，-70 ℃保存備用。反轉錄體系為20 μl：10 μl 2×RT buffer，1 μl 6N 隨機引物(100 pmol/μl)，1μl RT-mix，5 μl RNA模板，3 μl DEPC水。反應孵化條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，反應結束后短暫離心，-20 ℃保存備用。

1.3.5 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR反應體系50 μl：cDNA 2 μl，上、下游引物(25 pmol/μl)各1 μl，2×PCR buffer 25 μl，Sybr green I 0.5 μl，DEPC水20.5 μl。反應程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環35次，72 ℃檢測信號。每個樣品3個重復的檢測，以內參基因β-actin作對照，記錄各樣品的Ct值。

1.4 數據分析

實時熒光定量結果采用2-ΔΔCt法表示試驗組目的基因的相對表達量[3]，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組)。應用SPSS 16.0統計軟件分析各組數據，采用One-way ANOVA方差分析，LSD法進行多重比較。各處理結果用平均值(mean)±標準差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 鴨生長性能的比較

豌豆蛋白粉對鴨日增重、日采食量和料重比的影響見表3，C1和C3平均日增重極顯著低于C0(P<0.01)，C2日增重顯著低于C0(P<0.05)，其中C3比C0要低23.22 %。3個試驗組的平均日采食量隨豌豆蛋白粉添加比例的增加呈下降趨勢，C1和C3都極顯著低于C0(P<0.01)，C2顯著低于C0(P<0.05)，其中C3采食量降低最多，比C0低24.57 %。C2和C3料重比要低于C0，但差異不顯著(P>0.05)，C1的料重比相對于C0高0.22，且差異顯著(P<0.05)。

表2 目的基因及β-actin的引物序列

表3 豌豆蛋白粉對鴨生長性能的影響

注: 相同指標，不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: In the same line, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels．The same as below.

表4 豌豆蛋白粉對鴨血清激素水平的影響

2.2 鴨血清激素水平的比較

豌豆蛋白粉對4周齡高郵鴨血清激素水平的影響見表4。C2、C3的胰島素樣生長因子-I IGF-I水平顯著高于試驗組C1(P<0.05)，同時也高于C0但差異不顯著(P>0.05)。豌豆蛋白粉對生長激素GH、胰島素Insulin和瘦素Leptin3種激素水平的影響不顯著，各試驗組之間、以及與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 鴨生長相關基因表達量的比較

豌豆蛋白粉對4周齡高郵鴨胸肌、腿肌中生長基因GH、肥胖基因Obese、胰島素基因Insulin和 胰島素樣生長因子基因IGF-I4種與生長發育相關基因mRNA表達量的影響分別見圖1～2。

相同基因不同處理不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同In the same gene, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels. The same as below圖1 豌豆蛋白粉對鴨胸肌中生長相關基因表達的影響Fig.1 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the breast muscles of ducks

試驗組腿肌中GH表達量均不同程度高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；試驗組胸肌中GH表達量與C0差異不顯著，C2胸肌GH表達量最高，達到C0的1.5倍，同時極顯著高于C1(P<0.01)。C2和C3胸肌中Obese表達量要高于C0，但差異不顯著(P>0.05)；試驗組腿肌中Obese表達量也高于C0，其中C2組要顯著高于C0(P<0.05)。試驗組胸肌和腿肌中Insulin表達量(除C1組腿肌)均不同程度地高于C0，但差異不顯著(P>0.05)。C2、C3組胸肌和腿肌中IGF-I表達量均高于對C0組，但胸肌中差異不顯著(P>0.05)，腿肌中C2表達量要顯著高于C0(P<0.05)。

3 討 論

3.1 對鴨生長性能的影響

豌豆蛋白粉作為非常規飼料資源，其各種營養成分含量接近于大豆粕，可用作植物性蛋白質飼料。但與其他飼料相比，豌豆蛋白粉含有抗原蛋白、凝集素等抗營養因子，同時含有多酚類物質，具有一定的苦澀味，影響其適口性[4-5]。本試驗結果表明，豌豆蛋白粉替代豆粕降低了鴨的平均日增重和日采食量，這是由于豌豆蛋白粉抗營養因子和適口性的影響，特別是其添加比例為9 %時下降最明顯。李金喜在肉雞生產中的應用研究表明豌豆蛋白粉的使用降低了試驗雞的增重和采食量，但對料重比沒有顯著影響[6]，這也與本試驗研究基本一致。各試驗鴨的料重比除了3 %組顯著高于豆粕組，其余試驗組與豆粕組差異不顯著，結合增重和采食量2個指標，表明在3種豌豆蛋白粉使用量中添加6 %豌豆蛋白粉時鴨的養分利用效率最高。使用豌豆蛋白粉明顯降低了畜禽采食量和日增重兩個重要的生長性能指標，但考慮到豌豆為非轉基因食品和非過敏源、豌豆蛋白粉價格對于豆粕，加之試驗表明6 %豌豆蛋白粉組的料重比要高于豆粕組，因此豌豆蛋白粉替代豆粕后可以保障動物產品安全、降低飼養成本。

圖2 豌豆蛋白粉對鴨腿肌中生長相關基因表達的影響Fig.2 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the leg muscles of ducks

3.2 對鴨生長相關激素分泌及基因表達的影響

畜禽生長發育是一個極其復雜的生理過程，受到品種、營養、環境、飼養管理及動物疾病等多個因素的影響和控制。其中，營養等外在因素會通過調節神經內分泌激素的水平而影響畜禽生長，也會調控機體的基因表達量以影響畜禽的生長代謝。

生長激素(growth hormone, GH)位于“下丘腦—垂體—靶器官”生長軸的中心環節，是由腦垂體前葉合成和分泌的一種蛋白質激素。生長激素具有促進動物肌肉和骨骼等組織生長、調節機體新陳代謝、促進蛋白質合成和脂肪分解的生理功能。有研究表明，垂體中GH合成與血液中GH含量隨相對生長率的下降而降低，GH水平與禽類相對生長速度呈正相關，對促生長有積極意義[7]。本試驗結果顯示，使用豌豆蛋白粉或豆粕后GH分泌沒有差異，表明豌豆蛋白粉不影響鴨的GH分泌。GH基因是一種重要的與生長發育相關的功能基因。已有研究通過基因敲除、轉基因等技術驗證了GH基因與畜禽生長和生產性能有關[8]。本研究表明，豌豆蛋白粉的使用對鴨肌肉中GH基因的表達沒有影響，但添加6 %的豌豆蛋白粉后鴨胸肌中GH表達量達豆粕組的1.5倍。這一結果提示適當使用豌豆蛋白粉具有促進鴨生長發育的潛力。GH發揮生理作用主要通過兩種方式：一是作用于肝臟等靶器官，通過結合GH受體介導產生IGF-I，IGF-I再以內分泌方式進入血液，與結合蛋白結合后到達靶器官，作用于胰島素樣生長因子受體，從而調節畜禽生長發育；二是直接作用于靶器官的GH受體，通過旁分泌或自分泌IGF-I來直接影響細胞的代謝或調節組織器官的發育，從而調節生長發育[9-10]。胰島素樣生長因子-I(Insulin-like growth factor-I, IGF-I)與GH同為調控畜禽生長發育的重要因子，可由肝臟、肌肉等多個組織產生，從而發揮自分泌、旁分泌作用[11]。研究表明，IGF-I具有促進組織細胞的發育、增殖和分化的作用，以促進畜禽的生長發育[12]。本研究發現6 %豌豆蛋白粉可顯著提高鴨腿肌中IGF-ImRNA表達量，提示鴨體內GH主要通過第二種方式直接作用于肌肉組織，介導IGF-I的分泌以促進鴨生長發育。

胰島素(Insulin)是由胰腺分泌的一類代謝調控的激素，具有促進糖原、蛋白質和脂肪合成的作用。作為調節糖代謝最重要的激素，能降低畜禽體內血糖水平。本研究結果顯示，豌豆蛋白粉使用后對鴨Insulin激素水平和肌肉基因表達量沒有影響，這也進一步驗證了之前研究中豌豆蛋白粉對鴨血清葡萄糖水平沒有影響的結論。瘦素(Leptin)作為肥胖基因(Obese)的表達產物，是由脂肪組織特異分泌的蛋白類激素，可傳遞信號給下丘腦以調控畜禽攝食行為和機體能量代謝、減少體內脂肪蓄積[13]。本研究結果表明，使用6 %豌豆蛋白粉的鴨腿肌中Obese表達量顯著高于豆粕組的鴨，這也從分子層面解釋了前期研究中6 %豌豆蛋白粉鴨血清甘油三酯水平提高以降低脂肪組織沉積的原因。

4 小 結

使用豌豆蛋白粉替代豆粕影響到高郵鴨的平均日增重和日采食量，但6 %豌豆蛋白粉組的料重比顯著低于豆粕組，表明其養分利用率最高。使用豌豆蛋白粉對高郵鴨血清中GH、Insulin、Leptin、IGF-I4種激素的水平沒有顯著影響。使用豌豆蛋白粉對高郵鴨肌肉中Insulin表達沒有顯著影響，GH、IGF-I和Obese3個基因的表達普遍上調。試驗組中6 %豌豆蛋白粉基因表達成績最佳，該組GH表達量最高，腿肌中IGF-I和Obese的表達量顯著高于對照組，可部分揭示其促生長的分子機制。

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