貴州芒果畸形病病原菌的分離與鑒定

趙玳琳，王 廿，卯婷婷，陶 剛

(貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】芒果(MangiferaindicaL)屬漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬(Mangifera)，是世界第二大熱帶水果[1]。其在我國海南、云南、廣西、福建、廣東、四川、臺灣和貴州等熱帶及亞熱帶地區均有種植[2]。貴州省地處我國南亞熱帶北緣地區，是國家農業部確定的全國9個南亞熱作省區之一，適宜南亞熱作生產的土地面積達108.9萬hm2，芒果適宜種植區面積10.5萬hm2，可發展種植面積5.3萬hm2，優勢區面積2.3萬hm2，其中，南、北盤江及紅水河流域低海拔河谷地區(E104°14′～107°06′、N24°32′～25°52′)具備芒果種植的自然氣候及土壤條件[3]。芒果畸形病(mango malformation disease)是一種嚴重的世界性病害，1891年在印度首次被發現[4]，目前在非洲(埃及、南非、蘇丹、斯威士蘭和烏干達)、美洲(巴西、薩爾瓦多、墨西哥、尼加拉瓜、委內瑞拉和美國南部的佛羅里達州)、亞洲(印度、馬來西亞、緬甸、巴基斯坦和中國南部)、歐洲(西班牙南部)和中東(以色列和阿曼)等地廣泛分布[5-14]。在我國，芒果畸形病主要分布在云南和四川海拔較高的種植地區，且有進一步蔓延的趨勢[15-17]。該病害主要引起營養器官和花序畸形，致使花序坐果后不育或敗育而導致減產，平均產量損失達50 %～80 %，嚴重時絕產[18-19]。【前人研究進展】芒果畸形病的病因在學術界一直存在爭論，病因主要包括生理失調[20-21]、營養因素[22]、植原體[23]、病毒理論[24-25]、癭螨危害[26-27]和真菌侵染等[28-29]。自20世紀80年代以來，越來越多的研究結果表明，該病主要由鐮刀菌(Fusariumspp.)引起，不同地區病原鐮刀菌種類有所不同，目前報道引起該病的病原菌主要有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。【本研究切入點】黃海等[34]在貴州省興義市調查發現芒果畸形病的發生；貴州省植物保護研究所生物防治實驗室于2016年3月在貴州省興義市南盤江地區芒果種植園調查發現該病普遍發生，且對芒果的產量和品質造成嚴重影響，但目前尚未見有關貴州芒果畸形病病原菌準確鑒定的報道。因此，準確分離和鑒定是該病害科學防控的關鍵。【擬解決的關鍵問題】通過對貴州省興義市山地芒果基地發生芒果畸形病的病原菌進行分離、致病性測定、形態學觀察及rDNA-ITS序列分子系統學鑒定研究，以明確該病病原菌種類，為其科學有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)病原菌。具有芒果畸形病典型癥狀的芒果花序，2016年3月采集于貴州省興義市南盤江鎮田房村山地芒果種植園(N 24°52′21″，E 104°58′53″)。

(2)培養基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，馬鈴薯葡萄糖培養基(PDB)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離 采用方中達[35]的組織分離法分離病原菌。選取具有典型病害癥狀的芒果花序組織，用自來水輕輕沖洗干凈，在病健交界處切取面積約2 mm×2 mm的病害組織塊，用70 %的醫用酒精表面消毒20 s，再用5 % NaClO消毒30～60 s，無菌水沖洗3次，每次20 s，然后將組織塊接種于PDA培養基平板上，置于25 ℃、12 h光暗交替條件下培養，直至長出菌落。取菌落邊緣的菌絲進行繼代純化培養3代后保存于PDA斜面試管中，置4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.2 致病性測定 (1)離體接種。采用健康的芒果果實進行菌絲塊接種。果實經70 %酒精表面消毒后用無菌水沖洗去除殘留酒精，置于鋪有濕潤吸水紙的塑料盤中待用。將在PDA平板上25 ℃培養5 d后的病原菌菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊接種于果實上，每個果實接種2塊，6次重復，以接種空白培養基塊作為對照，用保鮮膜封住塑料盤保濕，置于25 ℃恒溫培養箱中12 h光照條件培養，分別于接種后1、3、5和7 d觀察記錄果實發病情況。

(2)活體接種。采用分生孢子懸浮液接種。將分離純化的菌株菌絲塊在PDB培養液中常溫振蕩培養(160 r/min)，5 d后過濾除菌絲體，配置成濃度為106個/mL的分生孢子懸浮液，在3年生健康芒果花序上用噴壺噴灑分生孢子懸浮液，3次重復，以噴灑清水為對照。接種后觀察記錄花序發病情況。

1.2.3 病原菌再分離 從接種發病果實和花序病健交界處分別剪取約2 mm×2 mm的病組織，按照上述組織分離法對致病菌進行再分離并進行種類鑒定，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.4 病原菌形態學觀察 將純化后的病原菌接種至PDA培養基，25 ℃黑暗培養5 d，觀察菌落及菌絲的顏色和形狀，鏡檢分生孢子的形狀、產孢結構及是否產生厚垣孢子等，分別測量50個大分生孢子和小分生孢子的大小，并顯微照相。參照文獻[36]的方法對分離病原物進行形態學鑒定。

1.2.5 ITS 序列分析及系統發育樹的構建 應用CTAB法提取病原菌基因組DNA，利用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1(5′-TCCGI.AGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌rDNA上的ITS區域進行PCR擴增[37]。ITS的PCR反應體系：滅菌超純水9.5 μl，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μl，ITS1 1 μl，ITS4 1 μl，DNA模板1 μl；擴增條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，由上海生物工程股份有限公司測序。

通過 Clustal-X 1.81軟件包[38]對所獲得的菌株MGXJB-1 ITS系列與GenBank數據庫中相似真菌ITS系列進行比對，再運用 BioEdit version 5.0.6對比對的結果進行手工校正，采用PAUP* 4.0 beta 10 軟件對系列數據進行最大簡約法分析，以啟發式搜索獲得系統發育樹，應用樹二等分再連接法作為啟發式搜索的算法。在系統進化分析中堿基序列間空缺(Gaps)作為堿基缺失處理，所有堿基狀態視為無序，不加權處理，經1000次重復計算自展檢驗值標記在分支上。

A:芒果畸形病害花序；B和D:致病性檢測的果實空白培養基對照和花絮清水對照；C和E:接種致病的果實和花序A.The inflorescence of mango infected with malformation disease; B and D.CK for fruit and CK for inflorescence; C and E.The fruit and inflorescence inoculated with pathogen MGXJB-1圖1 菌株MGXJB-1的致病性Fig.1 Pathogenicity of MGXJB-1 strain

2 結果與分析

2.1 芒果畸形病的病原菌及其致病性

2.1.1 病原菌 從采集的具有典型畸形癥狀病株的芒果花序(圖1A)樣品中分離到2種不同菌落特征的真菌，命名為MGXJB類型菌株和MGXJBO類型菌株，從MGXJB類型真菌分離純化獲得菌株1株，編號為MGXJB-1；從MGXJBO類型真菌分離純化獲得菌株2株，編號為MGXJBO-1和MGXJBO-2。2種類型真菌分離率均為22.2 %。

2.1.2 致病性 對3株菌株的致病性進行測定：①果實接種菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2均未出現病害癥狀，而接種菌株MGXJB-1 3 d后即可發病，發病率為100 %，5 d后病斑擴大，病斑為圓形水漬狀病斑(圖1 C)，空白對照組未發病(圖1B)。對接種發病果實病健交界處組織進行分離發現，所得菌株與原接種菌株形態一致。②芒果花序接種菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2不能致病，而接種菌株MGXJB-1 15 d左右植株花序即可發病，花軸變短變粗變褐，花序部分畸形，接種30 d左右，發病花序畸形并枯死(圖1 E)，噴灑清水對照組未發病(圖1 D)。取接種發病花序病健交界處組織分離獲得的菌株與原接種菌株形態一致。因此確定，MGXJB-1類型菌株為芒果畸形病的致病菌。

2.2 病原菌株MGXJB-1的形態學特征

菌株MGXJB-1在PDA培養基上25 ℃光暗交替培養5 d后菌落直徑達(5.38±0.07)cm，菌落呈圓形，邊緣整齊，基部無色素沉著，菌落背面略帶黃色(圖2A和圖2B)，氣生菌絲棉絮狀，顯微特征具有隔膜和分枝，分枝較細，直徑為 2～5 μm(圖2H)。產孢細胞著生于瓶狀小梗上，單瓶梗、雙瓶梗或復瓶梗，較長，瓶狀小梗細小，近圓柱形(圖 2E～G)；PDA培養基上產生大量的大型分生孢子，大型分生孢子散生于分生孢子梗上，紡錘形至鐮刀形，兩端較鈍，頂細胞略彎曲，基細胞鈍圓形或足跟不明顯，整個孢子形態較短、較粗，多數具3～5個隔膜，大小為(30.01±2.93)μm×(5.73±0.66)μm(圖2D)；小型分生孢子數量較少，多假頭狀著生于單瓶梗上，多為卵圓形、腎形和柱形等，大多單胞，極少數有1個隔膜，大小為(8.22±1.69)μm×(4.38±0.82)μm(圖2C和圖2D)，培養過程未見厚垣孢子，未見有性態和菌核產生，形態學特征與腐皮鐮刀菌(F.solani)特征一致。

2.3 病原菌株MGXJB-1的ITS序列測定與系統發育學

通過PCR擴增菌株MGXJB-1的ITS序列全長，根據ITS系列構建了鐮刀菌屬部分種類的分子系統發育樹(表1，圖3)。系統發育樹的拓撲結構中有2個鐮刀菌屬種的平行分支，其中，第一個平行分支包含2個近緣的鐮刀菌屬種類，病原分離物菌株MGXJB-1和腐皮鐮刀菌(F.solani)聚為一類(支持強度為88 %)，將其鑒定為腐皮鐮刀菌。同時，與F.equiseti相比，MGXJB-1和F.keratoplasticum有較近的親緣關系。菌株MGXJB-1在分子系統樹中與其他鐮刀菌屬種類的系統發育關系與形態學鑒定結果一致。

A～B:培養7 d的PDA菌落正面(A)和菌落背面(B)；C:小型分生孢子假頭狀著生于單瓶梗上；D:分生孢子；E～G:分別為大型分生孢子梗、單瓶梗(E)，雙瓶梗(F)，復瓶梗(G)；H:菌絲。標尺=25 μmA-B.Front side(A) and reverse side(B) of colonies cultured on PDA after 7 d; C.False heads of microconidia grown on monophialides; D.Conidia; E-G.Monophialide(E)，double monophialides(F) and multphialide(G); H.Hyphae. Scale=25 μm圖2 菌株MGXJB-1的形態學特征Fig.2 Morphological characteristics of MGXJB-1 strain

菌株Strain種名Speciesname地理來源GeographicoriginGenBank登錄號GenBankaccessionNo.Zbf-R4F.solaniChinaKX079482G6F.solaniChinaMF800959TVD_Fungal-Culture132F.solaniCanadaKF494130Zbf-R15F.solaniChinaKX064991UOA/HCPFAB90F.keratoplasticumGreeceKC254052HSf5F.keratoplasticumSaudiArabiaKR425650ATS53F.keratoplasticumIndiaKY436176IFM63624F.keratoplasticumJapanURLLC184267IFM57371F.keratoplasticumJapanURLLC184241G328F.equisetiUSAKR094440286-09F.equisetiSerbiaJQ41210932F.equisetiSouthAfricaKY318493MM11F.equisetiSpainKX343174CPC26370F.sarcochroumNetherlandsLT746256

3 討 論

芒果畸形病由鐮刀菌引起，目前經過柯赫氏法則驗證的有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。有研究報道，我國芒果畸形病病原菌主要有F.mangiferae和F.proliferatum，其他病原菌未見報道[39]。該研究對貴州省興義市的芒果畸形病病原菌進行分離鑒定表明，該病原菌為F.solani。Liew等[40]在芒果植株中分離得到F.solani，但最后證明不是芒果畸形病致病病原菌。F.solani是一種世界性分布的真菌種類，其可以作為腐生菌普遍存在于土壤、植物病殘體內，同時也能使許多植物致病，如侵染豆科植物(如黃豆、豌豆、豇豆、大豆等)和林木(如核桃、梨樹、國槐)引起植株根腐，還能侵染一些熱帶果樹造成潰瘍和頂端枯死癥狀，如鱷梨和柑橘[36,41-43]。該研究結果是國內首次發現F.solani能夠引起芒果畸形病害。

根據ITS序列構建的最大簡約樹，以F. sarcochroum為外群(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99)，分支上顯示的是展檢驗值等于或大于50 %(1000次重復)The structured the maximum parsimony tree according to ITS sequence based on F. sarcochroum(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99). The number on branches indicates the test value with equal to or greater than 50 %(1000 repetitions)圖3 菌株MGXJB-1與相關種的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of MGXJB-1 strain and related species

印度和墨西哥等國對芒果畸形病的流行特點研究表明，氣候條件與芒果畸形病的發生關系密切，氣溫較低的種植區發病較嚴重[39]。貴州氣候屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫15 ℃左右[44]，有利于該病害發生。喻群芳等[40]應用 Max Net 3.3.3.e 和Arc GIS9.3軟件對芒果畸形病在中國的潛在適生區進行預測表明，廣西、云南、海南、廣東、臺灣和貴州等省區均為該菌的潛在適生區。目前，我國只在進口巴基斯坦芒果植物檢驗檢疫要求中將芒果畸形病病原菌F.subglutinans列為檢疫性有害生物[39]。但該研究結果表明，F.solani能夠引起芒果畸形病害，鑒于該病害傳入我國的風險高性，建議擴大對芒果畸形病原種類如F.solani的檢疫，并加強檢疫措施，從而有效控制該病害的傳入和進一步擴散；同時，要積極開展芒果畸形病研究工作，建立芒果畸形病檢測和鑒定體系，結合我國國情制定相應的監測、檢疫及防控等相關方案，以達到及時發現與防控的目的。

4 結 論

貴州省興義市芒果畸形病害的病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani)，該病原菌為新發現的芒果畸形病致病菌。

致謝:在病害調查、試驗材料采集和活體接種方面得到貴州省植物保護研究所葉照春和李鴻波老師的指導和幫助，特此感謝！

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