鐵皮石斛黑斑病病原鑒定及生物學特性研究

孔 瓊，袁盛勇，王傳銘，薛春麗，郭建偉，李 珣，周銀麗，吳光梅

(紅河學院生命科學與技術學院/云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是一種蘭科石斛屬藥用植物，具有滋陰清熱，益胃生津，潤肺止咳等功效，富含石斛堿、石斛多糖等有效藥用成分[1]。由于大規模的采挖和自然繁殖率低等原因導致了鐵皮石斛野生資源稀缺，因此鐵皮石斛的人工種植逐漸增多。隨著人工種植面積的擴大和年限延長，大量的病害伴隨于鐵皮石斛的種植過程中，如炭疽病、疫病、黑斑病、莖基腐病、白絹病[2]，其中由黑斑病引起的鐵皮石斛病害發病較重，據筆者2012年4-12月于云南屏邊鐵皮石斛大棚種植基地的田間調查，發現該病發病率較重，高達30 %～50 %，嚴重影響了寄主植物的光合作用，從而導致了產量的降低。【前人研究進展】有關研究發現，鏈格孢菌(Alternariasp.)、葉點霉(Phyllostictasp.)、柱盤孢(Cylindrosporiumsp.)均能引起石斛屬蘭科植物發生黑斑病[3-8]，不同寄主或地理區域下，其黑斑病的病原不盡相同。如前人研究發現引起浙江義烏和永康鐵皮石斛、貴州赤水金釵石斛、云南屏邊齒瓣石斛黑斑病的病原均為細極鏈格孢(Alternaria.tenuissima)[3-4,7-8]，而引起云南普洱市民族傳統醫藥研究所試驗基地石斛的黑斑病為柱盤孢(Cylindrosporiumsp.)[6]?！颈狙芯康那腥朦c】對云南屏邊鐵皮石斛黑斑病病原和生物學特性方面的研究還未見報道，因此文章采取形態學和ITS序列對鐵皮石斛黑斑病的病原菌進行鑒定，同時對其生物學特性進行研究。【擬解決的關鍵問題】旨在對鐵皮石斛種植過程中該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年8月從云南屏邊鐵皮石斛種植基地采集鐵皮石斛黑斑病病標樣，采用組織分離法對病原菌進行分離[9]，并經柯赫氏法則驗證后確定2株鐵皮石斛黑斑病病原，菌株編號為SA4和SA5。

1.2 方法

1.2.1 病原菌鑒定 病原菌落形態、分生孢子、產孢表型等特征觀察方法根據《中國真菌志-鏈格孢屬》進行觀察和鑒定[10]。采用CTAB法提取SA4和SA5菌株的基因組DNA，通過真菌通用引物ITS1和ITS4進行病原菌rDNA-ITS序列擴增后[11]，送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，測序結果于NCBI中BLAST上進行比較分析，用MEGA5構建各基因系統發育樹，并用bootstrap對系統發育樹進行檢驗，1000次重復。

1.2.2 病原菌生物學特性研究 采用在PCA上培養7 d的菌種，菌絲塊大小為4 mm×4 mm，培養溫度為27 ℃(除測定溫度對病菌菌絲生長的影響外)，光照條件為L∶D=12∶12(除測定光周期對病菌菌絲生長的影響除外)，于培養第7天測定菌落直徑和產孢量[12]。不同培養基對病原菌菌落生長及產孢量的影響。將菌種分別接入馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養基(PCA)、胡蘿卜瓊脂培養基(CA)和查氏培養基(Czapek)5種培養基中，采用十字交叉法測量菌落直徑，同時測定產孢量。不同氮源對病原菌菌落生長及產孢量的影響。以查氏(Czapek)培養基為基礎培養基，以不加氮源作為對照，以甘氨酸、硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、氯化銨為替換氮源，置換Czapek培養基中的硝酸鉀，制成含有相同含氮量的不同氮源培養基。pH對病原菌菌絲生長及孢子萌發率的影響。將病原菌菌絲塊分別接種到pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的PCA上培養7 d并測定其菌落直徑。用病原菌的分生孢子分別制成pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的孢子懸浮液，24 h后檢測萌發率，每次檢測100個孢子，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發率。溫度對病菌菌絲生長的影響。將菌絲塊分別置于5、15、20、25、27、30、35 ℃不同溫度下進行恒溫培養，第7天測量菌落直徑。光周期對病菌菌絲生長的影響。菌絲塊接種于PCA培養基上，并置于全光照、光暗交替(L∶D=12∶12)和全黑暗條件下培養，于第7天用測量菌落直徑。

1.2.3 數據分析 試驗數據用DPSv7.05進行方差分析，再用Duncan法進行多重比較，數值表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 形態特征

2.1.1 SA4形態特征 SA4菌株于PSA培養基上培養6 d后，菌落中心略突起，直徑為5.39 cm，表面絮狀，灰色，背面黑色。在濕潤濾紙上產孢良好，培養7 d形成2～6個孢子的鏈，少分枝，分生孢子梗單生或數根簇生，分生孢子單生或短鏈生，卵形，倒梨形，倒棒狀，淡褐色至褐色。具橫膈膜1～4個，縱、斜隔膜0～4個。孢身大小11.819～31.012 μm×9.721～16.029 μm(平均21.42 μm×12.88 μm)，短柱狀假喙0.948～20.059 μm×1.897～4.307 μm(平均10.50 μm×3.10 μm)(圖1)。依據形態學特征，鑒定為鏈格孢(Alternaria.alternata)。

2.1.2 SA5形態特征 SA5菌株在PSA培養基上培養6 d，菌落中心略突起，直徑為5.63 cm，菌落表面密絨狀，圓形灰白色，背面棕黃色，在濕潤濾紙上產孢豐富，培養7 d形成4～10個孢子的鏈，多數分生孢子鏈不分枝，罕生的側鏈一般較短，分生孢子中間1～2個橫膈膜增厚，分生孢子梗單生或數根簇生，淡褐色，分生孢子鏈生，近球形，橢圓形，倒棒狀，具橫膈膜1～3個，縱、斜隔膜0～3個，孢身大小8.023～28.078 μm×9.370～14.360 μm(平均18.05 μm×11.87 μm)，柱狀假喙1.308～14.048 μm×2.392～4.499 μm(平均7.68 μm×3.44 μm)(圖2)。根據形態學特征，鑒定為細極鏈格孢(Alternariatenuissima)。

2.2 致病性測定

根據柯赫氏法則，將SA4和SA5菌株接種于帶有傷口的鐵皮石斛葉片上，得到了黑斑病的典型癥狀，對照CK不發病，無癥狀(圖3)。SA4菌株在接種的第2天開始發病，而SA5菌株于接種第4天才發病，隨著時間的推移，病斑逐漸擴大；第6天時，SA4菌株接種的葉片出現水漬狀和黑褐色的病斑，病斑較大，而SA5菌株表現為圓形的黑色病斑，且病斑較小。同時從病斑中重新分離獲得的病原菌與接種病原菌的菌落形態和菌體特征完全一致。

A: 菌落正面；B: 產孢表型；C: 分生孢子A: Front colony on PSA; B: Sporulation pattern; C: Conidia圖1 SA4菌株的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of SA4 isolate

A：菌落正面；B：產孢表型；C：分生孢子A: Front colony on PSA；B: Sporulation pattern；C: Conidia圖2 SA5菌株的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of SA5 isolate

2.3 ITS序列分析

以SA4和SA5菌株的DNA為模板，用ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，獲得1條介于500～750 bp DNA片段(圖4)，通過上海生工測序后發現SA4菌株的ITS DNA片段大小為528 bp，SA5為531 bp。將所獲得的序列與Gene Bank中鏈格孢屬(Alternaria)5個小孢子種(Alternarialongipes、A.gaisen、A.brassicae、A.alternata和A.tenuissima)的一些菌株進行序列同源性比對，同時選取4個相似屬[假格孢屬(Nimbya)、細基格孢屬(Ulocladium)、埃里格孢屬(Embellisia)，匍柄霉屬(Stemphylium)]一些菌株ITS序列，采用MEGA 5.22中的NJ法構建系統發育樹(圖5)。結果顯示SA4、SA5菌株與KC337037、KJ526175、HQ238277、JN108912、JQ004404的同源性高達99 %以上，同時聚在一個分枝，支持率為100 %，進一步支持了鐵皮石斛黑斑病的病原菌是鏈格孢屬(Alternaria)真菌，但無法鑒定到具體的種。

圖3 SA4和SA5菌株接種6 d時的發病癥狀 Fig.3 Symptom of black spot disease with SA4 and SA5 after being inoculated for 6 days

2.4 病原菌生物學特性

2.4.1 不同培養基對病原菌菌落生長及產孢量的影響 2種鏈格孢菌在PSA、PCA、PDA、CA、Czapek培養基上均能生長和產孢(表1)。PDA培養基有利于促進病原菌菌絲的生長，菌絲生長旺盛，直徑最大，且SA5菌株的菌落直徑明顯大于SA4菌株；而促進鏈格孢菌產孢的培養基為PCA培養基，該配方處理后的產孢量極顯著高于其他處理，其中SA4菌株的產孢量顯著高于SA5菌株的產孢量。

2.4.2 不同氮源對病原菌菌落生長及產孢量的影響 2種鏈格孢真菌對供試5種氮源均能利用，但菌落直徑差異較大，同時在不含氮源的培養基中也能生長，說明其對氮源要求不高，具體見表2。適合鏈格孢菌菌絲擴展的氮源是硝酸鈉、甘氨酸和蛋白胨，顯著或極顯著高于其他處理；而適合鏈格孢產孢的氮源為硝酸鈉；而氯化銨和硫酸銨處理的菌落直徑明顯低于其他3種氮源的處理，且均不產孢。

圖4 PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification of SA4 and SA5 with ITS1 and ITS4

2.4.3 pH對病原菌生長和孢子萌發率的影響 在PCA培養基中，鏈格孢菌絲生長和孢子萌發的pH值范圍較廣，對酸堿度有較強的適應能力。其中pH為6時，SA4和SA5菌株的菌落直徑最大，極顯著高于其他處理；而孢子萌發率最高的pH為8，其產孢量極顯著高于其他處理(表3)。

圖5 SA4和SA5菌株構建的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SA4 and SA5 with NJ method by MEGA

培養基DifferentmediaSA4SA5菌落直徑(cm)Colonydiameter產孢量(個)Sporulationquantity菌落直徑(cm)Colonydiameter產孢量(個)SporulationquantityPSA7.30±0.00Aa4.00±1.00Cd7.67±0.21Bb1.33±0.58BbPCA7.75±0.22Aa12.00±1.00Aa7.45±0.13Bb5.00±1.00AaPDA7.40±0.36Aa6.00±1.00BCc8.87±0.06Aa1.33±0.58BbCA5.32±0.13Bb8.00±1.00Bb6.03±0.15Cd2.00±1.00BbCzapek5.50±0.31Bb0.67±0.58De6.37±0.26Cc2.00±1.00Bb

注：不同小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著；不同大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著，下同。

Note: Different capital letters meant significant difference at the 5 % level, and different lowercase letters meant significant difference at the 5 % level. The same as below.

表2 不同氮源對病原菌菌絲生長和產孢量的影響

表3 不同pH對病原菌菌落和孢子萌發率的影響

2.4.4 溫度對病原菌菌絲生長的影響 SA4和SA5菌株在5～30 ℃范圍內均能生長，其中在25～30 ℃之間生長較快，最適生長溫度為27 ℃，其菌落直徑顯著高于其他處理；而低溫和高溫時，菌絲生長緩慢(表4)。

表4 溫度對病原菌菌落生長的影響

2.4.5 光周期對病原菌菌絲生長的影響 不同光照處理對鏈格孢屬真菌的菌落生長影響差異不顯著，說明菌絲生長對光照的要求不高(表5)。但是2個不同鏈格孢菌種之間存在一定的差異，SA4菌株(細極鏈格孢)在有光照時，菌絲生長較快；而是否有光照對SA5菌株(鏈格孢)的生長影響不明顯。

3 討 論

3.1 鐵皮石斛黑斑病的病原鑒定

大量研究發現，很多植物病原能引起寄主植物葉片、葉鞘、枝條、果實發生黑斑病。如Alternariasp.侵染引起牡丹、石楠、梨、棗果、人參等花卉園林苗木、果樹和中草藥的黑斑病[13-17]；福建琯溪蜜柚黑斑病的病原是由亞洲柑橘葉點霉(Phyllostictacitriasiana)和中華柑橘葉點霉(Phyllostictacitrichinaensis)引起[18]，而柑橘黑斑病則是由柑桔球座菌(Guignardiacitricarpa)造成的[19]；湖南水稻葉鞘黑斑病則由假彎孢(Cochliobolusfallax)侵染引起[20]。雖然感病寄主植物的發病癥狀均表現為黑斑，但病原和發病部位卻不同，其中大多數病原為植物病原真菌，同時也有例外，如杧果黑斑病的病原是細菌(Xanthomonascampestrispv.mangiferae-indicae)[21]。因而植物黑斑病的病原鑒定工作尤為重要，同時應根據病原和病害的田間流行規律制定出可行的防治措施。因此筆者調查了鐵皮石斛黑斑病的發生情況，并從田間采集病標樣進行室內鑒定，結果發現云南屏邊鐵皮石斛黑斑病病菌組成復雜，目前至少有2個種，分別為細極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)，其中細極鏈格孢(Alternariatenuissima)是在已報道的關于石斛黑斑病病原的文獻中較為常見的種，而鏈格孢(Alternariaalternata)較少有報道。

表5 不同光周期對病原菌菌落生長的影響

鏈格孢屬真菌屬級特征明顯，而種級特征由于受環境條件影響變異幅度較大。在真菌鑒定時須采用單孢分離純化后的菌種，同時嚴格按照現代鏈格孢分離國家標準方法進行鑒定，主要形態特征包括：分生孢子(形狀、大小、分隔情況、有無紋飾、產孢表型)；分生孢子梗(單生、簇生、分枝方式、延伸方式、產孢方式)；孢子鏈(長度及孢子數目)；喙(有無、形態、長短)[10]。同時文章對這2種鏈格孢菌進行了ITS序列分析，發現該方法無法區分這2種鏈格孢菌，因此在進行鏈格孢屬真菌種類鑒定時，應側重于形態學鑒定，同時結合分子生物學方法進行，其中分子鑒定采用多基因(如OPA2-1、OPA1-3、RPB2、endoPG)測序后構建系統進化樹進行區分。

3.2 病原菌生物學特性

文章對鐵皮石斛黑斑病病原細極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)的生物學特性研究發現，這2種病原真菌對營養要求不高，很多能培養真菌的培養基和氮源都適合其生長需求。菌絲生長最適培養基為PDA，產孢最適培養基為PCA；這與前人對其他鏈格孢屬真菌的研究結果相一致[22]。而對供試5種氮源均能利用，但是利用效率各有差異，最適氮源分別是蛋白胨和硝酸鈉，但是銨態氮則明顯抑制2種鏈格孢屬真菌菌絲的生長；菌落生長最適pH為6，孢子萌發的最高pH為8；光照的有無對2種病原菌的菌絲生長影響不大；病原菌在25～27 ℃生長速度最快，而35 ℃以上就難以生長。本研究結果與該病害在屏邊溫室大棚中易在6-8月侵染鐵皮石斛老葉，從而引起黑斑病的發病規律相吻合。

4 結 論

引起鐵皮石斛葉片黑斑病的病原菌為細極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)2種真菌，兩種病原菌的生物學特性有一定差異，且該病害易于高溫條件下傳播蔓延。

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