不同苧麻品種根際土壤細菌多樣性

湯滌洛，涂修亮，潘國雄，熊 偉，汪紅武

(1.咸寧市農業科學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北省苧麻工程技術研究中心，湖北 咸寧 437100)

【研究意義】微生物是地球上多樣性最高的生命形式[1]，幾乎分布到地球上的所有生境[2]，土壤中微生物數量龐大是最豐富的微生物資源庫[3]，而細菌是土壤中數量最豐富、分布最廣泛的微生物類群[4]，占有絕對優勢[5-6]。土壤細菌廣泛參與土壤有機質積累，參與土壤中大多數養分的轉化[7-8]，所以土壤細菌被作為評估土壤環境變化的指示型標志[9]，與土壤理化性質、土壤深度等諸多因素有關[10]。【前人研究進展】傳統的土壤微生物培養方法存在著耗時、工作量大的缺點，并且大多數土壤微生物是不可培養的，從而導致無法全面了解土壤微生物信息[11]。Illumina高通量測序技術為人們認識土壤微生物多樣性提供了新的契機。Illumina測序技術不僅具有低成本、高通量和低錯誤率的優點[12]，還能夠快速、簡單、較準確地獲取土壤微生物信息。【本研究切入點】本研究使用Illumina測序技術開展了不同根型苧麻土壤根際微生物多樣性研究。【擬解決的關鍵問題】探討苧麻根際土壤細菌與土壤養分的關系，不同根型苧麻土壤細菌多樣性，不同根型苧麻土壤細菌在不同分類水平的優勢類群、各類群相對豐度。為苧麻土壤微生物研究、土壤細菌與苧麻生產性狀相關性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗于2016年1-12月在咸寧市農業科學院崇陽縣白霓鎮山坡地示范基地進行。

供試苧麻品種分別為湖南中科院麻類研究所的深根型湘苧三號，湖北華中農業大學的中根型華苧四號，湖南張家界的淺根型黃殼麻。

1.2 試驗設計

試驗區3個處理分別(深根型湘苧三號、淺根型黃殼麻、中根型華苧四號)采用隨機區組排列，3次重復，共9個小區，其投影面積85 m2(17 m×5 m)，種苗全部采用統一繁殖的嫩梢扦插苗，2012年4月移栽。苧麻山坡地管理采用苧麻栽培一般管理方法執行。2016年采集不同品種苧麻根際土壤，每個小區多點取樣充分混勻，每份土樣分為2份，1份測土壤理化性質，1份用于分子生物學研究。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤成分的測定 土壤理化性質試驗于2016年三麻測產后分別取 0～20 cm土層混合土樣進行分析，分析方法為: 土壤有機質采用重鉻酸鉀-氧化還原滴定外加熱法；土壤速效磷采用 NaHCO3浸提-鉬銻抗吸光光度法；土壤速效氮含量用堿解堿解擴散法；土壤速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定；pH值用酸度劑測定法進行測定。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取及細菌的高通量測序 采用MOBIO公司的強力土壤 DNA 提取試劑盒提取土壤微生物基因組DNA。所提取的土壤總 DNA 濃度和純度經過核酸定量儀(NanoDrop ND-1000)檢測并純化后送至上海歐易生物公司進行測序。其測序步驟如下：根據測序區域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，KAPA 公司的 HiFi Hot Start Ready Mix 高保真酶進行 PCR，確保擴增效率和準確性。細菌多樣性鑒定對應區域：16S V3-V4 區，采用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')PCR 產物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪 PCR 模板，并進行二輪 PCR 擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對 PCR 產物進行 Qubit 定量。根據 PCR 產物濃度進行等量混樣，并上機測序。

1.4 數據處理及統計方法

使用 Trimmomatic 軟件對原始雙端序列進行去雜。去雜后的雙端序列利用 FLASH 軟件進行拼接。同時，利用 usearch 檢測并去除序列中的嵌合體序列。

測序數據進行預處理生成優質序列之后，采用 UPARSE 軟件，序列相似度大于或等于 97 %，將序列歸1個OTU(Operational taxonomic units)。使用 QIIME 軟件包挑選出各個 OTU 的代表序列并統計每個OTU中的豐度信息。利用 QIIME 軟件計算Chao1指數[13]、Shannon指數[14]和 Simpson 指數[15]。通過 SPSS 17.0[16]軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同根型苧麻種植地土肥狀況

從表 1 可知，不同根型苧麻種植山坡地土壤的有機質、速效氮有顯著性差，且中根型(B)最低。但是中根型(B)速效磷含量在3個品種是最高，并達到顯著性差異。速效鉀含量深根型(A)最高，有機碳淺根型(C)最高，pH值相差不大。

表1 不同根型苧麻種植山坡地土壤養分比較

注：數值為平均數±標準誤，不同字母表示差異顯著(α=0.05)。下同。

Note: Data in the table are mean±SE. Different small letters in the same row mean significant difference at 0.05 level among treatments.

表2不同處理土壤細菌序列讀數(reads)及OTUs數

Table 2 Reads and OTUs numbers of soil bacteria sequences in the different treatments

處理Treatment序列讀數ValidreadsOTUs數OUTs_counts深根型(A)28001±5311a2793±192a中根型(B)28416±4115a2473±153ab淺根型(C)28046±6452a2255±99b

2.2 土壤樣品測序

2.2.1 測序 通過測序將9個樣品中原始序列過濾掉低質量的序列后再拼接得到有效序列總數為278 279，根據Barcode標簽進行樣品序列拆分，在對初始序列進行去冗余處理后獲得257 100條Reads，然后在97 %相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU并統計，得出9個樣品共產生24 268個OTUs，測序讀長在 139～543 bp，平均測序長度在420 bp左右。每個處理的序列讀數數量如表2 所示。深根型(A)處理土壤含有最多數量的OTUs，其次是中根型(B)處理, 淺根型(C)處理OTUs數量最少。與深根型(A)相比，淺根型(C)處理土壤OUTs數量減少19.26 %，中根型(B)處理減少14.79 %。

2.2.2 OUT統計的圖形化展示 Venn 圖可直觀地表現出不同處理間 OTU的重疊情況[11]，而不同 OTU 代表不同物種，所以共有的OTU越多表示共有的細菌類群越多。從圖1可以看出，不同處理之間共有的細菌 OTU 數目為459 個。深根型(A)與中根型(B)共有OTU 數目最多623個，其次深根型(A)與淺根型(C)OTU 數目614個，中根型(B)與淺根型(C)OTU 數目522個。說明深根型(A)與中根型(B)共有的細菌類群最多(圖1)。

圖1 不同處理土壤細菌Venn圖Fig.1 Venn diagrams of soil bacterial in the different treatments

2.3 土壤細菌群落多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性指數包括Observed Species、Shannon 指數、Chao 指數、Goods Coverage、Simpson 指數等。Good’s Coverage(Good’s nonparametic Coverage Estimator)指數用來反映測序深度，首先由 Warren[17]提出；Observed Species 由樣品序列來表征觀測物種的多樣性指數；Chao指數用來估計群落中實際存在的物種數，其計算方法參見文獻[13]； Shannon指數反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高；Simpson指數反映了物種的優勢度。本研究在97 %相似度下，選取平均序列為25 010條的序列計算多樣性指數(表3)。

表3 不同處理土壤細菌豐富度及多樣性指數

表4 土壤細菌群落多樣性指數與土壤理化因子的相關性分析

注：*：顯著相關(P<0.05)；**：極顯著相關(P<0.01)。

Note:*:Significant level at 0.05 level; **:Significant level at 0.01 level.

3個處理中Good’s Coverage指數大于0.930接近1，表明測序深度基本已經覆蓋樣品中所有的物種。并且深根型(A處理)Observed species顯著高于其他2個處理12.31 %，18.52 %。深根型(A處理)Chao 指數顯著高于淺根型(C處理)13.86 %，與中根型(B)差異不顯著。深根型(C處理)Shannon指數顯著高于中根型(B)，與淺根型(C處理)差異不顯著。3個處理間的Simpson 指數差異不明顯。Observed species指數、Chao 指數、Shannon指數、Simpson 指數總體上呈現深根型(A處理)高于其他2個處理，說明深根型處理土壤細菌種群豐富度、土壤細菌優勢度高于其他2種處理。

2.3.2 細菌多樣性與土壤理化因子的相關性分析 由表4可知，Shannon 指數、Simpson 指數與pH值呈顯著負相關關系，與有機碳呈顯著正相關關系，與有機質、速效氮、速效鉀呈正相關關系，與速效磷呈負相關關系。Chao 指數與有機碳、pH值呈顯著負相關關系，與有機質、速效氮呈負相關關系，于速效磷、速效鉀呈正相關關系。總體來看，土壤細菌多樣指數與有機碳、pH值相關性較高，與速效鉀呈正相關關系。

2.4 樣品群落組成分析

2.4.1 細菌門分類水平的比較 在門分類水平上，3種不同根型苧麻根際土壤細菌分布在23個已知細菌門，1個未分類群體。由圖2可知，在3個處理中含量最高的門是擬桿菌門(Bacteroidetes)，其深根型(A)、中根型(B)、淺根型(C)相對豐度依次為(平均數47.39)48.59 %、47.24 %、46.34 %；其次是厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度依次為(平均數36.57)36.18 %、36.84 %、 36.68 %；變形菌門(Proteobacteria)相對豐度依次為(平均數11.45)10.80 %、11.24 %、12.31 %；而其他菌類比例相對較低，例如放線菌門Actinobacteria，梭桿菌門Fusobacteria，綠菌門Chlorobi等。表明在3 種不同根型苧麻根際土壤細菌中，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門為三大優勢菌群(相對豐度>10 %)，三者豐度之和達到95 %以上，而其他細菌類群為非優勢菌群。

圖2 細菌群落門組成Fig.2 Composition of soil bacteria at phylum level

2.4.2 細菌綱分類水平的比較 在綱的分類水平上,共得到40 個已知的細菌綱。如圖3所示，擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱(Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)，ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)，B-變形菌綱(Betaproteobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)類群等在細菌綱中相對豐度較大，相對豐度之和在 3 個處理土壤樣品中均占到土壤細菌總量的 80 %以上。相對豐度>10 %的優勢綱為擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱 (Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)；除極少數相對豐度極低的細菌綱,如熱原體綱(Thermoplasmata)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)、迷蹤菌綱(Elusimicrobia)等在3個處理 中的分布有所差異,其余已知豐度高的優勢細菌綱在 3 個不同根型處理中均有分布。

圖3 細菌群落綱組成Fig.3 Composition of soil bacteria at class level

圖4 細菌群落屬組成Fig.4 Composition of soil bacteria at genus level

2.4.3 細菌屬分類水平的比較 在屬分類水平上共得到289種細菌類群，優勢屬(相對豐度>1 %)有18個，如圖4所示，其中含量最高的是Other，在3個處理中相對豐度分別為21.19 %，24.86 %，22.13 %；其次是不可培養細菌(uncultured bacterium)，不可培養的擬桿菌屬(unculturedBacteroidalesbacterium)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，含糊不清的分類群(Ambiguous taxa)，毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae NK4A136 group)，普雷沃氏菌屬9組(Prevotella 9)，不可培養菌屬(uncultured)，擬桿菌屬等(Bacteroides)，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)。

3 討 論

本研究利用 Illumina MiSeq 測序技術通過對16S rRNA 基因的 V3～V4 高變區的測序分析，成功檢測了不同根型苧麻根際土壤細菌群落結構的多樣性，獲得了較全面的菌群信息。得到有效序列的總數為278 279，257 100條讀數(reads)，30 664個OTUs。測序讀長在 139～543 bp 之間，平均測序長度在420 bp左右。深根型(A)處理土壤含有最多數量的OTUs,其次是中根型(B)處理, 淺根型(C)處理OTUs數量最少。與深根型(A)相比,淺根型(C)處理土壤OTUs數量減少17.70 %,中根型(B)處理減少10.85 %。

Venn 圖表明不同處理之間共有的細菌 OTU 數目為459 個。深根型(A)與中根型(B)共有OTU 數目最多623個，其次深根型(A)與淺根型(C)OTU 數目614個，中根型(B)與淺根型(C)OTU 數目522個。說明深根型(A)與中根型(B)共有的細菌類群最多。

王伏偉、楊娟等[18-19]的研究表明土壤理化性質對土壤細菌群落組成有顯著的影響。本文Shannon 指數、Simpson 指數與PH值呈顯著負相關關系，與有機碳呈顯著正相關關系，與有機質、速效氮、速效鉀呈正相關關系，與速效磷呈負相關關系。Chao 指數與有機碳、pH值呈顯著負相關關系，與有機質、速效氮呈負相關關系，于速效磷、速效鉀呈正相關關系。總體來看，土壤細菌多樣指數與有機碳、pH值相關性較高，與速效鉀呈正相關關系。

樣品群落組成分析表明每個處理的土壤根際細菌優勢門(相對豐度>10 %)、優勢綱(相對豐度>10 %)、優勢屬(相對豐度>1 %)基本相同。土壤細菌優勢門(相對豐度>10 %)擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和 變形菌門(Proteobacteria)；優勢綱(相對豐度>10 %)擬桿菌綱(Bacteroidia)，梭菌綱 (Clostridia)，芽孢桿菌綱(Bacilli)；優勢屬(相對豐度>1 %)有18個。

本研究還發現苧麻根際土壤細菌中還有很多未分類物種，但其功能和特點尚不清楚，有待更深入的研究探索。

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