正交試驗法優化芹菜葉中綠原酸的提取工藝

河南省信陽職業技術學院，河南　信陽　464000

芹菜為傘形科多年生草本植物芹菜(ApiumgraveolensL.)的帶根全草，味甘、辛、微苦，性涼[1]?！侗静菥V目》記載：“旱芹，其性滑利”。芹菜在我國已有2000年的種植歷史，培育出了旱芹、水芹、西芹等多個亞種，其中以旱芹的藥用功效最好，是我國傳統的藥食兩用的中藥材，具有安神、利尿消腫、平肝降壓、養血補虛、清熱解毒、防癌抗癌、醒酒養胃等藥用功效，同時還具有減肥、美白的功效[1]。目前從金銀花、菊花、杜仲葉、山楂等中提取綠原酸的方法已有報道[2-5]，但是從芹菜中的提取分離綠原酸尚未見有報道。超聲波輔助提取的方法，有利于提高溶劑提取法的效率，縮短提取時間，減少溶劑用量，節能環保等[6]。筆者研究芹菜葉中綠原酸的提取工藝，以期為芹菜的綜合開發利用奠定基礎。

1　儀器與材料

1.1儀器GVT-15L功率可調式超聲波清洗機(深圳市夠威科技有限公司)；LC-20AB高效液相色譜儀(含SPD-M20A PDA紫外檢測器，日本島津)。

1.2材料綠原酸對照品(批號：110753-201610，中國食品藥品檢定研究院，純度：>98.0%)，芹菜葉(購于信陽市浉河區化工路丹尼斯，經信陽職業技術學院吳長忠副教授鑒定為傘形科草本植物芹菜(ApiumgraveolensL.)的葉，60 ℃減壓干燥至恒重)。甲醇(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)，乙醇(分析純，鄭州晟弘工貿有限公司)。

2　方法與結果

2.1綠原酸的含量測定

2.1.1吸收波長的選擇以甲醇為空白對照，用30μg/mL的綠原酸對照品甲醇溶液，在200～450 nm波長范圍內進行掃描，發現綠原酸在328 nm波長處有最大吸收，根據文獻[7]報道，芹菜中綠原酸的含量相對較低，為了提高檢測的靈敏度，選擇在綠原酸的最大吸收波長處測定其含量。

2.1.2色譜條件色譜柱：Luna C18ODS柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(30∶70)；檢測波長：328 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量10 μL。按照上述條件各組分分離度良好。采用外標法測定綠原酸的含量。

2.1.3方法學驗證根據文獻[7-9]的實驗方法制備標準曲線、驗證回收率、精密度、穩定性、重復性等，進行方法學考察。經過實驗得標準曲線為：Y=1.2×105X+8152.3(r=0.9998)，說明進樣量在0.01～1.00 μg范圍內與峰面積成良好的線形關系；加樣回收率分別為98.91%、99.42%、99.13%，RSD分別為1.92%、1.86%、1.75% (n=3)，表明該方法準確定良好；連續進樣6次，綠原酸峰面積的RSD為0.48%(<3%)，說明儀器精密度良好；穩定性試驗說明24 h內綠原酸供試品溶液穩定性良好。

2.2提取溶劑的選擇綠原酸可溶于熱水，易溶于乙醇和丙酮?？紤]到成本和毒性的原因，選用純化水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇作為溶劑，按照“2.4.2 制備工藝”項下方法，進行單因素試驗考察溶劑對綠原酸提取的影響，并按“2.1含量測定”項下的方法，測定提取液中綠原酸的含量。結果見表1。

表1　不同溶媒的提取效果

由上表可知，以75%乙醇作為提取溶劑時，綠原酸的提取率比較高，因此采用75%乙醇作為提取溶劑。

2.3提取次數的選擇選用75%乙醇作為提取溶劑，按照“2.4.2 制備工藝”項下方法，進行單因素試驗考察提取次數對綠原酸的累積提取量的影響，并按“2.1含量測定”項下的方法，測定提取液中綠原酸的含量。結果見圖1。

由上圖可知，當提取次數超過3次時，累積提取量的增加已經非常緩慢，而且第3次的累積提取量已經達到六次的總累積提取量的97.3%。因此，為了簡化濃縮等后處理的需要，選用提取3次。

2.4超聲波樣品提取液的制備

2.4.1工藝設計選用L9(34)正交實驗，參考有關文獻，選取表2中四個因素設計正交試驗因素水平。結果見表2、表3。

表2　正交實驗表

2.4.2制備工藝取干燥至恒重的芹菜葉10.0 g精密稱定，用提取溶劑浸泡30 min超聲提取3次，合并提取液，濾過，濃縮，用甲醇稀釋到適宜的濃度，得到超聲樣品[5-6]。

2.5樣品含量測定將L9(34)正交試驗的提取液按“2.1項下含量測定法”進行測定。由表3、4可知，超聲波的功率和超聲提取的時間是影響超聲提取的主要因素(P<0.05)，而其他兩個因素的影響較小。最佳方案的為：A1B3C2D3,即在功率300 W條件下，超聲40 min，用10倍的用量的75%乙醇作為溶媒提取3次為最佳工藝條件。

表3　正交試驗結果分析

表4　方差分析

2.6驗證實驗采用優化后的超聲提取法，提取芹菜葉中的綠原酸。提取結果為1.43 mg/g、1.39 mg/g、1.42 mg/g、1.41 mg/g、1.45 mg/g和1.38 mg/g，RSD為1.83%。由此可知，優化后的超聲提取法提取芹菜葉中的綠原酸，提取效率高，實驗方法簡單易行，操作穩定性好。

3　討論

綠原酸是植物的次生代謝產物之一，具抗氧化、抗菌、抗病毒、保肝利膽、解痙和抗誘變等多種藥理活性[10]。由于綠原酸分子內含有鄰二酚羥基和雙鍵等易氧化的基團，并含有酯鍵等易水解的基團，導致其化學性質不穩定，具有還原性，易被氧化，同時也不耐高溫，高溫時容易分解失效。因此本實驗采用可以密閉提取的超聲波提取法，以提高綠原酸的提取率，減少提取過程中溫度和氧氣對綠原酸的破壞作用。

芹菜葉主要含有蛋白質、纖維素、碳水化合物、維生素、微量元素等對人體有益的物質，同時還含有黃酮、多糖、綠原酸等具有藥理活性的化合物，具有降壓、消腫、抗癌、安神、止血、健胃和補虛等臨床應用。本研究為芹菜在食品和藥品領域的進一步開發奠定了一定的基礎。

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