HPLC法同時測定養心氏片中9個指標性成分

上海東方肝膽外科醫院藥材科，上海　200438

養心氏片是由十三味中藥組成的復方制劑，處方包含黃芪、淫羊藿、黃連、炙甘草、黨參、山楂、醋延胡索、丹參、地黃、靈芝、葛根、當歸和人參。具有扶正固本、益氣活血、行脈止痛的功效，常用于氣虛血瘀型冠心病、心絞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等癥[1-2]。養心氏片所含的活性成分如黃酮類成分葛根素、大豆苷、蘆丁、芹菜素均有明顯的擴張冠狀動脈，保護心肌缺氧性損傷的作用[3]；生物堿類成分延胡索乙素有鎮靜鎮痛的作用[4]；酚酸類成分丹參素有活血化瘀的功效[5]。

目前養心氏片的研究多為臨床應用方面的報道，與含量測定相關的研究多為其中單個成分的測定，如黃芪甲苷和葛根素的測定[6-9]，2015版《中國藥典》含量測定項下僅有黃芪甲苷的HPLC測定。單個成分的測定作為養心氏片的質量控制不夠全面。而由于組分復雜，同時測定其中的黃酮類、生物堿和酚酸類難度較大，目前亦未見相關報道。本研究采用高效液相色譜法同時測定了養心氏片中9個指標性成分，方法簡便、準確，為養心氏片的質量控制及后期的作用機制研究提供基礎。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(含G1379A真空脫氣機、G1311A四元泵、G1367A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器，美國安捷倫公司)；KUDOS- SK2200H超聲發生器(上海科導超聲儀器公司)；METTLER AE240型十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2材料葛根素(批號：110752-201615)、大豆苷(批號：111738-201603)、丹參素(批號：110855-201614)、蘆丁(批號：100080-201610)、延胡索乙素(批號：110726-201618)、淫羊藿苷(批號：110737-201516)、芹菜素(批號：111901-201603)、人參皂苷Rd(批號：111818-201603)、阿魏酸(批號：110773-201614)購自中國食品藥品檢定研究院(純度>98%)；養心氏片(批號：150406，上海醫藥集團青島國風藥業股份有限公司)；色譜級甲醇購自Burdick&Jackson公司，色譜級乙腈購自Merck公司，色譜級甲酸購自Fluka公司，水為純化水，其余試劑為分析純。

2　方法和結果

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液如表1所示，精密稱取如下樣品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作為對照品儲備液，存于4 ℃冰箱，待用。

2.1.2標準曲線的配制精密吸取上述對照品儲備溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混勻，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐級稀釋，制得標曲溶液。

2.1.3樣品溶液的制備取2片養心氏片樣品，剝除包衣放進研缽碾碎，精密稱取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，制得樣品溶液。

表1　對照品儲備液的配制

2.2色譜條件色譜柱：Agilent Plus-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；流動相：A乙腈- B水(含0.1%甲酸)，A相隨時間的變化：5%～40%(0～35 min)，40%(35～45 min)；檢測波長：254 nm、310 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL；分析時間：35 min；柱后平衡時間：10 min。混合對照品、養心氏片樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3線性關系考察養心氏片中各化合物的標準曲線、線性范圍及相關系數見表2。

表2　養心氏片中各化合物的線性關系

2.4精密度試驗取2.1.1項下制備的系列混合對照品溶液，在1 d內連續進樣6次以及連續3d每天進樣3次，根據所得峰面積分別考察日內和日間精密度。結果9個指標性成分的日內、日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的精密度良好。

2.5定量限和檢測線考察將9個對照品溶液依次進行稀釋，以信噪比10∶1時，確定其最低定量限；以信噪比3:1時，確定其最低檢測限。9個指標性成分的最低定量限分別為5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低檢測限分別為2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。

2.6穩定性實驗取制備的養心氏片樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定9個成分的峰面積，考察其穩定性。結果9個成分峰面積的RSD分別為2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7重復性試驗精密稱取同一批次養心氏片1g，共6份，按2.1.3項下方法，分別制成樣品溶液進樣分析。結果，養心氏片中9個成分含量的RSD均小于5%，表明該方法的重復性良好。

2.8加樣回收率實驗精密稱取同一批次養心氏片0.5 g，共6份，分別加入對照品一定量 (樣品中各成分含量的100%)，按2.1.3項下方法制備，進樣分析，計算回收率。9個成分的加樣回收率和RSD(n=6)分別為101.42%(RSD=1.48%)、102.74%(RSD=3.87%)、98.91%(RSD=1.67%)、199.35%(RSD=2.58%)、99.27%(RSD=3.27%)、98.59%(RSD=2.73%)、100.32%(RSD=3.42%)、102.53%(RSD=1.17%)、100.41%(RSD=3.63%)，回收率結果良好。

2.9樣品測定養心氏片中各化合物的含量通過線性方程計算。見表3。

表3　養心氏片中各成分的含量

3　討論

在色譜柱的選擇上，考慮到待測成分較多，極性差別大，為了提高分離度，選用了250 mm長柱進行分析。由于同時測定組分較多，未能保證所有峰分離度均>1.5，其中葛根素和蘆丁分離度>1.2，考慮到兩者含量較高，為指標性成分，納入了測定項，后期考慮用MS法準確定量。

在流動相的選擇上，因各成分的參考流動相比例不同，采用了乙腈-水體系，梯度洗脫，從結果看，各成分可同時檢測，分離度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹參素等成分出現拖尾峰，還可以抑制樣品解離[10]。在檢測波長的選擇上，由于各成分的最大吸收波長各不相同，為了統一測定條件，并考慮到阿魏酸的特征吸收，同時選擇了254 nm和310 nm兩個波長，其中310 nm測定阿魏酸，254 nm測定其余8個成分。

由樣品測定結果可見，養心氏片中多個活性成分含量穩定，其中治療氣虛血瘀的藥如丹參、人參和葛根中所含的丹參素、人參皂苷Rd、葛根素的含量較高，符合本制劑的組方特點。本研究可同時測定養心氏片9個指標性成分的含量，方法簡單，穩定可靠，可用于養心氏片的質量控制。

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[5]張為. 養心氏片治療冠心病慢性心力衰竭氣虛血瘀證的臨床研究[D].北京：北京中醫藥大學, 2007.

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