60Co誘變大豆滯綠突變體M6變異分析

溫宏偉，王 鵬，李貴全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

在植物衰老的過程中，葉片葉綠素降解，出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，植株的生物產(chǎn)量減少。有些植株在生育末期葉片衰老過程中，葉綠素不降解或降解不明顯，葉片和果實(shí)保持綠色，這種現(xiàn)象稱為滯綠（stay-green）現(xiàn)象[1]。豆科植物中普遍存在滯綠現(xiàn)象[2]，如菜豆[3]、豌豆[4]等突變體，滯綠突變體是研究葉綠素代謝、植物衰老進(jìn)程等過程的理想材料。在大豆滯綠突變體中，存在2個(gè)隱性滯綠基因，分別為子葉滯綠基因D1和種皮滯綠基因D2，其中，D1被定位在大豆第1條染色體上；D2基因被定位在第11條染色體上[5]，Gm SGR1和Gm SGR2基因分別負(fù)責(zé)大豆子葉和種皮滯綠[6]。

大豆種皮色及大豆子葉色會(huì)影響大豆的外觀，而大豆外觀與其商品質(zhì)量存在著密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致種皮顏色差異的自然產(chǎn)物包括類黃酮和花青素[7]，對(duì)抗氧化性的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生一定的影響，因此，種皮色是一個(gè)育種后代評(píng)估的重要形態(tài)標(biāo)記，有 5 個(gè)位點(diǎn)（I，T，W1，R，O）參與控制其性狀的形成[8]。

不同株系、不同品種農(nóng)藝性狀差異較大[9-10]，滯綠突變體外在表型特殊具有一定的研究?jī)r(jià)值。本試驗(yàn)利用60Co-γ射線輻射處理Z-94320（雙青豆）大豆風(fēng)干種子，在M6獲得108個(gè)突變系，對(duì)其中的40個(gè)突變系從農(nóng)藝性狀、生物學(xué)性狀、衰老時(shí)期葉片葉綠素含量及蛋白質(zhì)方面進(jìn)行分析，旨在為大豆滯綠突變體的利用及種皮顏色的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年，采用60Co-γ射線輻射處理滯綠突變體Z-94320（雙青豆）大豆風(fēng)干種子，劑量率為1.6 Gy/min，種植收獲得到M1，2013年種植得到M2，在M2中選擇優(yōu)良變異單株以及特殊變異個(gè)體，經(jīng)過幾年的連續(xù)選育，到2017年獲得M6，共108個(gè)突變體品系。

1.2 試驗(yàn)方法

2016年5月9日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆育種試驗(yàn)田播種M5種子，收獲M6突變體108種材料，行長(zhǎng)5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重復(fù)3次，常規(guī)田間管理，生育期調(diào)查記錄主要生物性狀，利用SPAD-502葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉片葉綠素含量。成熟后，每株系隨機(jī)抽取5株進(jìn)行農(nóng)藝性狀室內(nèi)考種，測(cè)產(chǎn)。測(cè)定的農(nóng)藝性狀主要有株高、株質(zhì)量、結(jié)莢高度、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝、主莖莢數(shù)、分枝莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、3粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、癟粒莢數(shù)、總莢數(shù)、蟲食數(shù)、百粒質(zhì)量以及單株粒質(zhì)量[11]。用InfratecTM 1241 Grain Analyzer V5.00品質(zhì)分析儀對(duì)大豆的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)量。對(duì)照為滯綠突變體 Z-94320（雙青豆）（CK）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0，Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滯綠突變體后代主要生物學(xué)性狀的變異分析

對(duì)M6突變系中的108個(gè)株系的17個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由表1可知，M6突變系中在株質(zhì)量、株高、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、2粒莢數(shù)、3粒莢數(shù)、總莢數(shù)、單株粒質(zhì)量這8個(gè)農(nóng)藝性狀方面的均值和CK相比，變化較大。M6突變系中各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小分別為：4粒莢數(shù)（115.04%），分枝莢數(shù)（87.93%），癟粒莢數(shù)（71.59%），蟲食數(shù)（65.45%），3粒莢數(shù)（64.41%），有效分枝（52.22%），1粒莢數(shù)（49.51%），2粒莢數(shù)（48.04%），結(jié)莢高度（45.42%），單株粒質(zhì)量（44.30%），株質(zhì)量（43.60%），總莢數(shù)（39.68%），主莖莢數(shù)（27.92%），百粒質(zhì)量（8.02%）。結(jié)果表明，在M6突變系中可以著重從4粒莢數(shù)、分枝莢數(shù)、3粒莢數(shù)以及結(jié)莢高度和單株粒質(zhì)量這幾個(gè)具有潛力的農(nóng)藝性狀中選擇適合選育目標(biāo)的材料。

表1 突變體M6農(nóng)藝性狀及蛋白質(zhì)均值和變異系數(shù)

從圖1可以看出，大豆滯綠突變體誘變后代中，相對(duì)于對(duì)照的種皮，誘變后代中出現(xiàn)了種皮色的變異（A2），種皮顏色為綠到黃以及中間的過渡色（A1，A2），在M6的 108個(gè)突變系中，按種皮色分類可將其分為 4 類（I，II，III，IV），以 12 號(hào)為代表的突變系I中，種皮色為綠色，子葉色為綠色；62號(hào)代表的突變系II中，種皮色為淺綠色，子葉色為綠色；104號(hào)和74號(hào)代表的突變系III中，種皮色為淺綠色，子葉色為黃色；96號(hào)和106號(hào)代表的突變系IV中，種皮色為黃色，子葉色為黃色，而對(duì)照株系種皮色和子葉色均為綠色。M6突變系中豆莢色發(fā)生變異（A4），出現(xiàn)黃褐色（95）、淺褐色（98）、褐色（90）、深褐色（19）4種。在M6突變系中出現(xiàn)分枝數(shù)增多、莖稈變粗的株系（A5），16號(hào)材料可作為突變系中重點(diǎn)關(guān)注的材料。

2.2 滯綠突變體后代葉片葉綠素含量比較

從M6突變系中選出40個(gè)突變系，按種皮色和子葉色分為 4 類（I，II，III，IV），每一類 10 個(gè)株系。

從圖2，3可以看出，種皮色和子葉色均為綠色的CK和M6突變系在苗期和盛花期葉綠素含量變化不大，大部分材料在衰老期葉綠素含量相對(duì)于盛花期呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在II類突變系中，苗期到盛花期間葉綠素含量變化不大，在盛花期到衰老期大部分突變系葉綠素含量保持不變，少數(shù)突變系葉綠素含量呈上升趨勢(shì)。

從圖4可以看出，在III類突變系中，在苗期到盛花期間不同株系的葉綠素含量有升有降，其中，28，65號(hào)突變系在這個(gè)期間呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在盛花期到衰老期間，在衰老的過程中，74號(hào)材料的葉綠素含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其他材料葉綠素含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

由圖5可知，在IV類突變系中苗期到盛花期葉綠素含量變化不大，在衰老期葉綠素含量降幅明顯。結(jié)果表明，在大豆植株衰老的過程中，種皮色和子葉色與葉片葉綠素含量有著一定的關(guān)系，種皮色和子葉色均為綠色的突變系中，存在著滯綠現(xiàn)象，種皮色越綠葉片葉綠素含量越高，而黃色的突變系中存在黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致衰老期葉片葉綠素下降。種皮色一致的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量下降幅度小甚至出現(xiàn)葉綠素含量上升的趨勢(shì)。

2.3 滯綠突變體后代蛋白質(zhì)分析

由表1可知，M6的108個(gè)突變系中蛋白質(zhì)含量的變幅為40.9%～46.5%，與對(duì)照株系的44.3%相比，有增有減，蛋白質(zhì)的變異系數(shù)為2.49%。對(duì)M6選出的40個(gè)株系的蛋白質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，M6-84的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到46.5%，其種皮色和子葉色均為綠色；M6-105的蛋白質(zhì)含量最低，為40.9%，其種皮色和子葉色均為黃色。蛋白質(zhì)均值從大到小排序?yàn)椋篒（44.06%）＞II（43.91%）＞III（42.84%）＞IV（42.78%）（表2）。結(jié)果表明，大豆滯綠突變體中，綠色種皮、綠色子葉的大豆蛋白質(zhì)含量相對(duì)高于黃色種皮、黃色子葉的大豆突變系，且滯綠大豆的蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，均值達(dá)到44%左右。

表2 滯綠突變體M6蛋白質(zhì)含量及其均值 %

3 討論與結(jié)論

利用輻射誘變技術(shù)，育種家已經(jīng)選育出大量的優(yōu)良品種，如水稻脆性突變體[12]等。楊凱敏等[13]對(duì)60Co誘變晉大78的M5表型性狀進(jìn)行變異分析，為誘變育種幫助加快選育高產(chǎn)大豆品種提供一定理論依據(jù)。本試驗(yàn)對(duì)大豆滯綠突變體M6的農(nóng)藝性狀、生物性狀、衰老期葉片葉綠素、蛋白質(zhì)的變異及變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，108個(gè)突變系中，4粒莢數(shù)、分枝莢數(shù)、3粒莢數(shù)及結(jié)莢高度和單株粒質(zhì)量變異潛力大，例如，對(duì)照的單株粒質(zhì)量為14.02 g，而誘變后代的突變系中單株粒質(zhì)量變幅為7.45～62.61 g，變異系數(shù)為44.3%，在產(chǎn)量方面具有巨大的潛力，從中可選育出高產(chǎn)突變系。有研究通過對(duì)不同百粒質(zhì)量野生大豆的生物學(xué)性狀分析發(fā)現(xiàn)，隨著百粒質(zhì)量的增加，大豆粒色逐漸由以黑色為主到出現(xiàn)了多種顏色，臍色由以黑色為主到有褐色和深褐色[14]。在突變系中，種皮顏色出現(xiàn)了變異，呈現(xiàn)出從綠到黃色的過渡變異，將其分為4種類型：I.種皮色、子葉色均為綠色；II.種皮色為淺綠色，子葉色為綠色；III.種皮色為淺綠色，子葉色為黃色；IV.種皮色和子葉色均為黃色。子葉色出現(xiàn)了黃色變異，可能是控制種皮色和子葉色的基因位點(diǎn)發(fā)生了改變或缺失，有待進(jìn)一步從基因?qū)用嫔线M(jìn)行研究。

滯綠突變體誘變后代滯綠特性有減弱趨勢(shì)[15]，通過對(duì)突變系葉片葉綠素分析發(fā)現(xiàn)，在大豆衰老期過程中，葉片葉綠素含量變化與種皮色和子葉色有一定的關(guān)系，種皮色越綠，葉片葉綠素含量越高，且不降解，認(rèn)為這類突變系為功能性突變體[16]；而黃色的突變系中，衰老期葉片葉綠素下降。種皮色一致的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量下降幅度小甚至出現(xiàn)葉綠素含量上升的趨勢(shì)，這可能與衰老期葉綠素降解受阻有關(guān)。輻射誘變對(duì)品質(zhì)的改良起到一定作用[17-18]，本研究通過蛋白質(zhì)分析，結(jié)果表明，大豆滯綠突變體中，綠色種皮、綠色子葉的大豆蛋白質(zhì)含量相對(duì)高于黃色種皮、黃色子葉的大豆突變系，且滯綠大豆的蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，均值達(dá)到44%左右。這與薛樹鵬等[19]對(duì)大豆科豐14研究得出的誘變后代蛋白質(zhì)含量降低結(jié)果不一致，可能是由于突變系材料不一致導(dǎo)致的。今后可以在分子基因方面，深入研究種皮色、子葉色與品質(zhì)方面的關(guān)系，以獲得優(yōu)質(zhì)的突變系材料，為育種工作作出新的貢獻(xiàn)。

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