氯磺隆和鎘復合污染對菠菜幼苗生理指標的影響

趙麗娟 ，張 洪 ，解靜芳 ，張建華

（1.忻州師范學院生物系，山西忻州 034000；2.山西大學環境與資源學院，山西太原 030006；3.山西省分析科學研究院，山西太原 030006）

氯磺隆作為磺酰脲類除草劑的代表品種，在我國的玉米栽培中被廣泛使用，但是施用過程中產生了諸多問題，其中最為突出的是農田土壤中的殘留藥害[1]。STORK[2]報道，氯磺隆在土壤中的殘留可持續3～5 a，從施用到分解的過程中，氯磺隆降解至初始濃度的1%的時間需要33～63個月，并且仍然會對后續播種的敏感作物產生一定的藥害。同時，我國北方地區由于缺水而導致的工業污水灌溉極為普遍，從而造成了土壤中重金屬鎘（Cd）積累。在土壤中，Cd對作物的毒害作用較為突出，因此，《土壤環境質量標準》規定，Cd的限定值比其他重金屬（Hg，Pb，Cr，As）更加嚴格[3-5]。作物通過土壤吸收和污水灌溉之后，Cd濃度在組織中產生積累，作物生理表現為：植株矮化、根系發黑變短，甚至會出現分蘗受抑制，以致于作物的品質和產量都會下降[6]。目前，由于現代工業和農業生產的迅速發展，農田土壤體系中的單一污染幾乎不存在，多種污染物共同作用于作物常有發生。

本試驗通過對土壤中的氯磺隆單一污染及氯磺隆和鎘的復合污染下，菠菜幼苗抗氧化酶活性和葉綠素含量的變化研究，旨在為土壤中2種污染物對波菜的聯合毒性提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

菠菜（Spinacia oleracea L.）種子為日本翠玉大菠（山西大豐種業有限公司）。

1.2 試劑及儀器設備

谷胱甘肽-S-轉移酶試劑盒（上海紀寧公司）；氯化鎘（GR）（天津科密歐公司）；萬分之一天平（AL104，METTLER TOLEDO公司）；光照培養箱（LI15，美國SHELLAB有限公司）；紫外分光光度計（UV2100，UNICO公司）；高速冷凍離心機（JXN-30，BACKMANCOULTER公司）。

1.3 方法

根據氯磺隆對菠菜生長的抑制率進行預試驗，設置土壤中氯磺隆含量分別為0.000 1，0.000 3，0.001，0.003，0.005 mg/kg。根據文獻研究，國內污灌區農田土壤中Cd濃度最高可達5.0 mg/kg[7-8]，因此，選取5.0 mg/kg作為土壤中Cd的添加量。毒理學試驗設單一污染和復合污染2組，單一組只添加5個不同濃度的氯磺隆，復合組為Cd（5.0 mg/kg）＋5個不同濃度的氯磺隆。每組設空白對照，每個處理6次重復。

將500 g耕作層土與氯磺隆和Cd混合均勻，裝入缽體種植菠菜。種子埋好，放入光照培養箱。保持12 h晝夜交替，相對濕度（RH）40%～60%；溫度（20±2）℃；每日固定時間給菠菜澆水。當作物幼苗長出2片真葉時，每缽定植5株。菠菜種植至第40天，取各處理組的植株進行葉綠素含量、抗氧化物酶活性的測定。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 波菜的抗氧化酶活性的測定 取0.2 g菠菜樣品，加入5 mL內含1%的聚乙烯吡咯烷酮、pH值為7.8的磷酸鹽（PBS）溶液，0℃下進行研磨，設置離心機6 000 r/min，4℃離心10 min。取上清液，進行酶活性測定[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍四唑法進行測定[10]。過氧化物酶（POD）采用愈創木酚法進行測定[11]。過氧化氫酶（CAT）測定方法參考李合生[12]的《植物生理生化實驗原理和技術》進行。谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）采用上海紀寧公司生產的試劑盒進行測定。

1.4.2 丙二醛（MDA）和葉綠素含量的測定 取菠菜樣品0.5 g，5 mL0.1%三氯乙酸冰浴研磨，7 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸，95℃水浴充分反應30 min，放置室溫，10 000 r/min 離心 8 min。于 605，530，455 nm 測定吸光值。計算MDA含量[13]。

稱取菠菜0.1 g，加入8 mL80%丙酮溶液研磨，7 000 r/min離心10 min。上清液在663，645 nm測定吸光值，推算總葉綠素的含量[14]。

1.5 數據分析

數據均取3次重復的平均值，采用標準差和T檢驗的方法分析不同處理之間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同處理對菠菜SOD活性的影響

細胞中O2-·主要由SOD進行清除，O2-·可由SOD催化轉化為H2O2和O2，由此阻止生物膜脂質過氧化反應，從而對生物膜起到保護作用[15]。

圖1結果顯示，與對照相比，Cd單一污染對SOD酶活性不會產生顯著影響。當土壤中氯磺隆含量超過0.003 mg/kg時，菠菜食用部分中的SOD活性才會顯著增加（P＜0.05）；Cd與氯磺隆的復合污染與氯磺隆單一污染相近，同樣為氯磺隆含量超過0.003 mg/kg時，SOD活性顯著增強。2組試驗結果表明，土壤中氯磺隆的含量對菠菜體內的SOD產生主導作用，Cd影響不顯著。

2.2 不同處理對菠菜POD活性的影響

POD是植物體內所產生的一類氧化還原酶，能催化很多反應。在植物代謝中，由于各種生理還原底物不同而具有不同的功能，主要對H2O2的清除起關鍵作用[16]。

在氯磺隆的單一和復合污染處理組，菠菜POD隨著氯磺隆含量的升高，活性顯著增強（P＜0.05），當氯磺隆含量為0.000 3 mg/kg時，單一污染對菠菜POD酶活性與對照之間無顯著差異，但是在加入Cd之后，菠菜處于二者的聯合暴露，POD活性顯著上升（P＜0.05）。表明2種污染物的聯合作用對菠菜的生理產生更強的毒性，且二者呈現正相關效應（圖 1）。

2.3 不同處理對菠菜CAT活性的影響

CAT可清除植物組織中H2O2，使之分解成O2和H2O，主要存在于植物過氧化物酶體內，是植物體內重要的酶促防御系統之一[10]。

由圖2可知，氯磺隆單一暴露下，隨著氯磺隆含量的增加，菠菜CAT活性顯著增強（P＜0.05）。與對照相比，Cd單一暴露組CAT活性無顯著性差異（P＞0.05）。在Cd和氯磺隆聯合暴露下，CAT活性較氯磺隆單一暴露組增強更快，由此表明，二者的聯合暴露會對CAT活性會產生刺激作用。

2.4 不同處理對GST活性的影響

GST可以催化還原型谷胱甘肽（GSH）與各種親電子外源化合物發生結合反應，從而防止親電子外源化合物進入生物體內產生有毒物質，從而達到解毒的作用，是植物體內重要的解毒酶。對各種有機污染物、農藥、重金屬可起到解毒的作用[17-18]。

氯磺隆單一污染、氯磺隆與Cd復合污染對菠菜中GST的影響相同，都呈現出隨濃度增加GST先上升后下降的趨勢（圖2），可能是由于菠菜暴露在混合污染物中，在低濃度時，GST參與對外源毒物的解毒反應，因此，活性上升；但隨著暴露含量的增加，其體內底物GSH被大量消耗，從而導致GST的活性迅速降低。

2.5 對菠菜中MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要分解產物，其含量可以反映生物的抗性生理指標，進而間接地表達膜系統受到傷害的程度。從圖3可以看出，菠菜在氯磺隆單獨暴露下，土壤中農藥濃度含量為0.000 3，0.001 mg/kg時，MDA含量顯著上升，在0.005 mg/kg濃度時表現為含量顯著下降，其總體趨勢表現為隨著氯磺隆含量濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢。

復合污染處理組，菠菜的丙二醛含量在5.0＋0.003 mg/kg顯著升高（P＜0.05），5.0＋0.005 mg/kg處理組顯著下降（P＜0.05），其余處理組與對照相比，無顯著性差異（圖3）。在2種復合污染物的同時暴露下，其總體變化趨勢為：隨著氯磺隆濃度的增加，MDA的含量呈先上升后下降，但是下降的趨勢要比氯磺隆單獨暴露出現的濃度更低。其可能是由于低含量氯磺隆單一和聯合暴露組，都尚未對菠菜細胞膜和細胞造成傷害；而當氯磺隆含量達到一定的閾值時，細胞膜被損傷，隨即產生MDA的積累；之后呈下降趨勢，則可能是因為抗氧化酶活性的增強，清除了過多的活性氧，從而保護細胞膜，使得MDA含量恢復到正常水平。

2.6 不同處理對菠菜葉綠素含量的影響

由圖3可知，隨著氯磺隆含量的增加，菠菜中葉綠素含量出現顯著下降（P＜0.05）。與對照相比，氯磺隆含量達到0.005 mg/kg，菠菜的葉綠素含量下降到0.6 mg/g。

與空白相比，Cd誘導菠菜葉綠素含量顯著下降（P＜0.05）。Cd造成菠菜葉綠素含量下降的原因可能是由于Cd離子會減少菠菜中葉綠體基粒、類囊體的數量，破壞葉綠體結構，從而致使葉綠素含量降低[19]。氯磺隆與Cd復合污染后，未加快菠菜葉綠素含量的下降，由此可見，復合污染物對作物葉綠素含量未產生協同作用。

3 結論與討論

氯磺隆在單一污染和復合污染過程中均會誘導菠菜幼苗中SOD，CAT，POD活性顯著升高。Cd的單一污染對菠菜幼苗POD，SOD，CAT和GST這4種抗氧化酶活性不產生顯著影響；復合處理組與氯磺隆單一處理組和Cd單一處理組相比較，POD和CAT活性在復合處理組均顯著加強，由此表明，Cd和氯磺隆復合對POD和CAT活性可產生刺激作用，這樣可使植物清除體內過多的活性氧和H2O2，MDA含量與二者的變化趨勢相同，也可對此進行印證。此外，GST活性在復合污染處理高濃度組顯著下降，表明谷胱甘肽除了需要結合氯磺隆，還需結合重金屬Cd，由于結合的底物較單一污染多，所以，酶活性下降較快。綜合以上各種酶活性變化結果表明，當氯磺隆和Cd共同作用菠菜幼苗時會產生正協同效應。單一污染與復合污染都會降低菠菜幼苗中的葉綠素含量，但是2種處理間無顯著性差異。

參考文獻：

［1］張紹明.淺談氯磺隆等長殘留除草劑藥害及治理對策 [J].雜草學報，2005（4）：1-2.

［2］STORK P R.Field leaching and degradation of soil applied herbicides in a gradationally textured alkaline soil:chlorsulfuron and triasulfuron[J].Australian Journal of Agricultural Research，1995，46：1445-1458.

［3］王世斌，姜勇，梁文舉.沈陽西郊污灌區農田土壤鎘污染特征研究[J].沈陽建筑大學學報（自然科學版），2006，22（3）：450-453.

［4］張乃明.太原污灌區土壤重金屬污染研究 [J].農業環境保護，1996，15（1）：21-23.

［5］栗獻峰.太原市污灌區土壤重金屬分布特征及風險評價 [J].山西農業科學，2012，40（7）：742-746，774.

［6］王錦文，邊才苗，陳珍.鉛、鎘脅迫對水稻種子萌發對幼苗生長及生理指標的影響[J].江蘇農業科學，2009（4）：77-78.

［7］曾德付，朱維斌.我國污水灌溉存在問題和對策探討[J].干旱地區農業研究，2005，22（4）：221-224.

［8］陳志凡，趙燁，郭廷忠，等.污灌條件下重金屬在耕作土壤中的積累與形態分布特征：以北京市通州區鳳港減河污灌區農用地為例[J].地理科學，2013，33（8）：1014-1021.

［9］王學奎.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2015.

［10］JIANGL，MAL，SUI Y，et al.Effect ofmanure compost on the herbicide prometryne bioavailabilitytowheat plants[J].Journal ofHazardous Materials，2010，184：337-344.

［11］ ZHOU Z S，HUANG S J，YANG Z M.Biological detection and analysis of mercury toxicity to alfalfa（Medicago sativa）plants[J].Chemosphere，2008，70：1500-1509.

［12］李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2001.

［13］ LU Y L，LIANG L，YANG H.Joint ecotoxicology of cadmium and metsulfuron-methyl in wheat（Triticum aestivum）[J].Environ Monit Assess，2013，185：2939-2950.

［14］PORRA R J，THOMPSON R A，KRIEDEMANN P E.Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvent verifications of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy[J].Biochimica et Biophysica Acta，1989，975：384-394.

［15］何俊瑜，任艷芳，任明見，等.Cd對小麥種子萌發、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響[J].華北農學報，2009，24（5）：135-139.

［16］ ZHOU Z S，GUO K，ELBAZ A A，et al.Salicylic acid alleviates mercurytoxicitybypreventingoxidative stress in roots of Medicago sativa[J].Environmental&Experimental Botany，2009，65（1）：27-34.

［17］ YIN X L，JIANG L，SONG N H，et al.Toxic reactivity of wheat（Triticum aestivum）plants toherbicide isoproturon[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2008，56：4825-4831.

［18］郭玉蓮，陶波，鄭鐵軍，等.植物谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）及除草劑解毒劑的誘導作用 [J].東北農業大學學報，2008，39（7）：136-139.

［19］RIVERA-BECERRIL F，CALANTZIS C，TURNAU K，et al.Cadmium accumulation and buffering of cadmium-induced stress by arbuscular mycorrhiza in three Pisum sativum L.genotypes[J].J Exp Bot，2002，53：1177-1185.