對EDTA-K2依賴性假性血小板減少不同檢測方法結果的比較

郭　謙1,2，王曉健1,2，曹　榮2，張愛愛2，張文平

(1.山西醫科大學，山西 太原　030001；2.山西省汾陽醫院，山西 汾陽　032200)

國際血液學標準委員會自1993年起就將EDTA-K2抗凝劑推薦為全血細胞計數儀的首選抗凝劑[1]。隨著各種全自動血球計數儀的普及，EDTA-K2抗凝劑的使用也越來越廣泛，但是在用EDTA-K2抗凝劑進行血常規檢驗時部分患者會出現EDTA-K2誘導血小板聚集的現象，聚集以后的血小板體積變大，使得傳統的電阻抗檢測法無法檢出聚集以后的血小板，而使血小板計數假性減低，造成臨床誤診[2]，找出解決此問題的解決辦法是十分必要的。本研究對20例由EDTA-K2抗凝劑誘導血小板假性減少的患者用不同的方法進行血小板計數，然后對計數結果進行比較，從而找出可以準確計數EDTA-K2依賴性血小板假性減少患者血小板的方法。

1　資料與方法

1.1　一般資料

收集2016年7月～2017年4月EDTA-K2抗凝靜脈血在Sysmex XE-2100全自動血細胞分析儀上首次檢測血小板計數結果低于100×109/L(血小板低于100×109/L應復檢),推片復檢發現血小板聚集，且無可以導致血小板減少的疾病及病史，無出血癥狀的20例患者的血液標本。

1.2　儀器與試劑

Sysmex XE-2100全自動血細胞分析儀和Sysmex KX-21血液分析儀及原廠家提供的配套試劑；靜脈血EDTA-K2真空抗凝管、枸櫞酸鈉真空抗凝管由蘇州碧迪醫療器械有限公司提供；Olympus雙目顯微鏡；20μL微量采血管由天津市薊縣興達公司提供；一次性靜脈采血針由湖北仙明醫療器械有限公司；0.2 g/2 mL阿米卡星注射液由珠海貝索醫藥公司生產；瑞氏-吉姆薩復合染液嚴格按照標準操作規程配置[1]。

1.3　實驗方法

1.3.1EDTA-K2抗凝靜脈血電阻抗法及光學法檢測使用Sysmex XE-2100全自動血液分析儀對患者的EDTA-K2抗凝靜脈血進行血小板計數，電阻抗法通過儀器第3通道(CBC+DIFF)進行檢測，光學法通過儀器第4通道(CBC+DIFF+RET)進行檢測，同時觀察血小板直方圖形態。每個患者分別作3次平行測試取平均值，并且推片觀察血小板的分布情況。

1.3.2EDTA-K2抗凝靜脈血加入阿米卡星后檢測取1 000μLEDTA-K2抗凝靜脈血于試管中，向其中加入 0.2g/2 mL的阿米卡星60μL(預實驗效果最佳)，混勻，靜置30 min后在Sysmex XE-2100全自動血液分析儀的電阻抗通道進行檢測，同時觀察血小板直方圖形態。每個患者做3次平行測試取平均值，并且推片觀察血小板分布情況。

1.3.3枸櫞酸鈉抗凝靜脈血檢測使用Sysmex XE-2100全自動血液分析儀的電阻抗通道對患者的枸櫞酸鈉抗凝靜脈血進行血小板計數，每個患者作3次平行測試取平均值，同時觀察血小板直方圖形態并推片觀察血小板的分布情況。

1.3.4末梢血檢測取一潔凈試管加入500μL稀釋液，取患者20μL末梢血液加入稀釋液中，混勻，使用Sysmex KX-21三分類儀進行檢測，每個患者做2次平行測試取平均值并觀察血小板直方圖形態。同時用末梢血立即推片，觀察血小板分布情況。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　血小板計數結果比較

對于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血光學法與電阻抗法血小板計數結果均較低，小于100×109/L，二者差異無統計學意義(P>0.05)；枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血的血小板計數結果均在100×109/L以上，與EDTA-K2抗凝靜脈血的血小板計數結果，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～4。

表1　EDTA-K2抗凝靜脈血電阻抗法與光學法血小板檢測結果比較　×109/L

表2　不同抗凝劑抗凝靜脈血血小板檢測結果比較　×109/L

表3　不同類型血液標本血小板檢測結果比較　×109/L

表4　EDTA-K2抗凝靜脈血加入阿米卡星前后血小板計數結果比較　×109/L

2.2　血涂片血小板分布情況比較

對于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片顯示血小板聚集；末梢血、枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血的血涂片顯示血小板散在分布或3～5個成簇分布。見圖1、2。

2.3　血小板直方圖形態比較

對于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血(電阻抗法和光學法)于Sysmex XE-2100儀器上檢測時，血小板直方圖峰值下降并出現翹尾現象；枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血于相同儀器檢測時峰值正常并無翹尾現象發生。見圖3～5。

圖1EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片的血小板分布情況

圖2枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片的血小板分布情況

圖3EDTA-K2抗凝靜脈血血小板直方圖

圖4枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血血小板直方圖

圖5末梢血血小板直方圖

3　討論

目前，臨床上常用的全自動血液分析儀進行血小板計數的方法有電阻抗法和光學法[3]。電阻抗法主要通過細胞的體積大小來區分血小板和紅細胞。光學法用熒光染料使細胞內的核酸著色，再用相應波長的激光照射，利用表達細胞大小的前向散射光和表達細胞內核酸濃度的側向熒光來識別血小板[4]。血小板體積較紅細胞小，在散點圖中分布在紅細胞下方，血小板內含極少量的核酸，側向熒光的強度較成熟紅細胞稍大，因此能有效區分紅細胞和血小板。電阻抗法只能檢測體積在2～30fL內的血小板[5]，當EDTA-K2誘導血小板發生聚集而體積增大后，電阻抗法檢出的血小板數量偏低。光學法理論上可以檢出所有體積大小的血小板[5]，但此項研究表明光學法對EDTA-K2誘導的發生聚集的血小板檢出結果與電阻抗法的檢出結果差異無統計學意義(P>0.05)。也就是說，當EDTA-K2誘導血小板發生聚集后，電阻抗法和光學法的檢測結果不準確，不能正確反映患者的血小板數量。

EDTA-K2可以誘導血小板聚集是因為EDTA-K2可以激活血小板，使血小板表面的隱匿性抗原結構發生改變，與血漿中存在的自身抗體發生特異性的抗原抗體反應，從而激活許多生物活性物質，如磷脂酶A2、5-羥色胺、ADP等。這些生物活性物質可以活化纖維蛋白原的受體，促進血小板與纖維蛋白原結合，從而使血小板發生聚集。阿米卡星是一種氨基糖苷類的抗生素，可以抑制EDTA-K2對血小板的激活作用，避免血小板隱匿性抗原的結構發生改變，因而可以抑制EDTA-K2誘導的血小板聚集[6]，糾正血小板計數假性減少的現象。

血小板本身就具有聚集的功能，正常人非抗凝血的血涂片上常可以見到3～5個血小板成簇分布的現象[7]，因此本實驗中20例患者的末梢血涂片出現3～5個血小板成簇分布的現象是正常的。

電阻抗法只能在2～30fL內分析血小板，正常的血小板直方圖峰值在8fL左右，在20～30fL范圍內幾乎與基線重合[7]。當EDTA-K2誘導血小板發生聚集，體積增大后，體積在8fL左右的血小板數量下降，而20～30fL體積范圍內及體積大于30fL的血小板數量增加，使得血小板直方圖的峰值下降，并且20～30fL范圍內的部分曲線上揚而出現翹尾的現象。

本實驗表明，對于EDTA-K2依賴性的假性血小板減少的患者，更換抗凝劑、采集末梢血，加阿米卡星均可以糾正血小板計數，但應根據實際情況選擇適當的方法。如：有文獻報道個別EDTA-K2依賴性血小板聚集的患者枸櫞酸鈉、肝素抗凝劑也可引起其血小板聚集[8]，此時更換抗凝劑的方法就無法糾正血小板計數，可以采集末梢血或添加阿米卡星來進行血小板計數。

在實際檢驗工作中，應該重視復檢工作，嚴格按照“41條復檢規則”[9]對血小板計數低于100×109/L的標本推片復檢，觀察血小板的數量及分布情況(金標準)[1]。如發現血小板聚集的現象，應及時與臨床溝通，若患者沒有可以導致血小板減少的疾病和出血癥狀，并排除采血等人為因素，則應該及時采取有效的措施重新計數患者的血小板，保證發出準確的檢驗報告。

對于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，應該根據具體情況，可以更換抗凝劑或者采集末梢血進行血小板計數，還可以向1000μL EDTA-K2抗凝血中加入0.2 g/2 mL阿米卡星60μL，混勻，放置30 min后再進行檢測。

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[9]劉俊閃.EDTA-K2抗凝劑致血小板假性減少現象及糾正方法的分析[J].臨床醫藥文獻雜志，2015,2(8)：1442.