微生物葡萄糖氧化酶的研究進展

李 蓉，張慶芳，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）EC 1.1.3.4是一類含有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，FAD）的二聚體蛋白酶，能夠以分子氧為電子受體，特異性催化β-D-葡萄糖轉化為葡萄糖酸，并產生H2O2，具有廣泛的應用價值[1]。GOD作為制造葡萄糖檢測傳感器的重要酶制劑[2]，在醫療領域和發酵工業應用較多。GOD作為食品添加劑，能夠抑菌、延長商品貨架期、防止食物褐變以及用于生產低酒精度紅酒[3]。此外，GOD還可用于生產燃料電池和飼料添加劑，在能源領域和養殖業中有潛在應用價值[4-5]。GOD廣泛存在于微生物及昆蟲體內，前者因繁殖快、操作簡單、成本低等優點，已成為GOD資源開發的主要來源[6-7]。本文介紹了GOD的微生物來源、分離純化、發酵、克隆表達、應用方面的研究進展，并對研究前景進行了展望，旨在深入了解GOD，為其理論研究及生產應用提供參考。

1 GOD的微生物來源[8-10]

自黑曲霉（Aspergillusniger）中的GOD首次被發現以來，研究者在多種微生物中檢測到GOD，其中曲霉屬（Aspergillus sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）為GOD的主要來源。近年，在一些酵母和細菌中也發現GOD。隨著高通量篩選技術的應用，相信會有更多產GOD菌株被發現。

1.1 真菌來源

MULLERD[11]在1928年首次于黑曲霉（A.niger）無細胞提取物中發現并命名了GOD；1936年又首次于灰綠青霉（Penicillium glaucum）中發現GOD[12]。之后，大量產GOD的曲霉和青霉屬真菌被發現。真菌因產酶量高，成為目前GOD研究的主要對象。2013年，FARID M A等[13]首次從黑曲霉（A.niger）NRC中分離到GOD，將GOD生產推向海洋領域。2015年，KRIAA M等[14]從塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）CTM 507中分離到GOD，該GOD在pH 3～9的范圍內酶活穩定，具有抗真菌活性，首次表明該GOD能夠用于農業病原菌防治。2017年，YUIVARY等[15]檢測了多株南極酵母，從中篩選到5株產GOD菌株，其中，G.gastricus分泌的GOD酶活最高，催化效率達到1.4×107mol/（L·s）；最適反應pH 5.6；最適反應溫度64℃，相比黑曲霉（A.niger）、尼崎青霉（Penicillium amagasakiense）等來源的GOD在25～40℃條件下有更高的酶活，并且在4℃仍保留約10%的酶活，拓寬了GOD的低溫真菌來源。

國內對GOD的系統研究始于20世紀70年代。葡萄糖氧化酶協作組[16]從367株青霉和曲霉中篩選到GOD高產菌點青霉（Penicillium notatum）AS 3.3871，以蔗糖為碳源，NaNO3為氮源，振蕩培養后經靜置，酶活達到15～18 U/mL。發酵液經弱酸性陽離子交換柱層析后濃縮，得到GOD酶制劑，用于處理蛋清，能夠除去其中的葡萄糖，有效防止干蛋白片的褐變。2013年，朱運平等[17]從全國120余份土樣中篩選到高產GOD的黑曲霉（A.niger）1504，該菌株同時合成胞外GOD（55.08 U/mL）和胞內GOD（80.58 U/mL），經紫外-亞硝酸鈉復合誘變，獲得遺傳穩定性高的突變菌UNⅡ021，其胞外GOD酶活達到186.32 U/mL。江南大學酶工程實驗室長期從事GOD研究，從最初的菌株篩選，到黑曲霉（A.niger）Z-25的god基因異源表達于巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）提高產量，再到對重組菌進行改造，于2015年使GOD酶活達到1 634.7 U/mL，為有史以來報道的最高值[18]。

1.2 細菌來源

目前關于產GOD細菌的報道較少。2013年，雷湘南等[10]從2 835株細菌中初篩出490株產酸菌，后經發酵復篩出7株產GOD細菌。經鑒定，6株為桿菌，1株為球菌（見表1）[12-14]。其中4株分泌胞外GOD，有2株為蒼白桿菌，蒼白桿菌B2059酶活最高，為0.1779μmol/mL。2014年，石漱鈺等[19]首次報道了產GOD的海洋假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株所產GOD酶活達5.51 U/mL，最適催化溫度20℃，為低溫酶，最適反應pH 7.0，在低溫保鮮、食品低溫加工中有潛在應用價值。

表1 葡萄糖氧化酶微生物來源Table 1 Microbial source of glucose oxidase

2 GOD的克隆表達及發酵生產

2.1 GOD的克隆表達

通常野生菌株GOD產量較低，發酵時伴隨其他酶的分泌，增加了GOD的分離純化難度，對GOD產業化造成了嚴重影響。隨著分子生物學技術的發展，基因克隆和表達成為提高GOD產量的重要措施。目前，多種來源的GOD被克隆，并在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（P.pastoris）、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）以及青霉屬（Penicillium sp.）等宿主中成功表達[20-21]。

1995年，GEISEN R[22]將黑曲霉（A.niger）的god基因插入pSK+3.Sma載體，導入納地青霉（P.nalgiovense）ATCC 66742后獲得成功表達，GOD酶活得到提高。之后有研究發現[3]，霉菌在發酵過程中，菌絲會影響攪拌效果，導致菌體與發酵液接觸不良，造成GOD產量低。繼而酵母菌憑借蛋白產量高、產物與菌體易分離等優點成為深層發酵的最佳宿主[23]。2003年，MALHERBED F等[3]將黑曲霉（A.niger）的god基因成功表達于釀酒酵母（S.cerevisiae），并研究了GOD在低酒精度紅酒生產中的應用。過去幾十年，釀酒酵母（S.cerevisiae）被認為是GOD異源表達的有效體系，但最近研究發現，以S.cerevisiae為表達系統，會引起重組GOD的高糖基化表達[12，24]。畢赤酵母（P.pastoris）系統可有效表達蛋白，而不會導致GOD的過度糖基化，已成為應用最廣泛的表達系統之一[25-26]。2014年，GAOZW等[1]首先克隆了點青霉（P.notatum）F4的god基因，根據畢赤酵母（P.pastoris）密碼子偏好優化基因，然后插入pPIC9載體，并導入畢赤酵母（P.pastoris）GS115表達，發酵后，GOD酶活達到615U/mL，蛋白質量濃度達2.5 g/L，超過發酵液上清中總蛋白濃度的80%。2017年，陳楠等[26]將黑曲霉（A.niger）PCTC的god基因插入具有AOX1強啟動子的pPICZαA表達載體，后導入畢赤酵母（P.pastoris）SMD1168，經篩選、產酶條件優化，最高酶活達到32 U/mL。

2.2 GOD的發酵優化

GOD可由固態或深層發酵法生產，其發酵研究有近30年[27]的歷史。雖然大量菌株可合成GOD，但因低產量問題無法直接用于工業生產。發酵優化是提高酶產量的重要方式，隨著專業軟件的發展，GOD發酵優化從傳統的單因素優化法逐漸發展到統計優化法。2001年，KONA RP等[28]對黑曲霉（A.niger）進行GOD發酵優化，以玉米漿為唯一營養物質，使GOD酶活從（580±30）U/mL提高至（850±45）U/mL。2016年，郭云瑕等[29]對紫外誘變后的黑曲霉進行單因素發酵條件優化，以5%接種量，在30℃、160 r/min條件下發酵72 h，酶活達到優化前的9.56倍。2013年，FARID M A等[10]對海洋黑曲霉（A.niger）NRC9進行GOD發酵培養基優化，首先利用單因素設計，篩選出對GOD發酵最為重要的4個因素：葡萄糖、CaCO3、（NH4）2HPO4和MgSO4，之后利用部分析因設計和響應面法，確定最適發酵培養基。經過發酵優化，酶活從（109.81±1.38）U/mL提高至（170±0.88）U/mL。

大量研究結果表明[30]，在GOD發酵生產中，碳源是主要的誘導劑，最適碳源通常是葡萄糖、蔗糖或糖漿，在發酵過程中控制高碳氮比通常會得到更高的GOD產量。CaCO3也為發酵所必需，可誘導GOD合成，防止發酵過程中pH降低、提高GOD產量。此外，Fe2+、Zn2+等金屬離子也可作為誘導劑誘導GOD的產生[31]。而GOD生產過程中，H2O2會抑制GOD的合成。

3 GOD的分離純化

為研究酶的結構和功能以及推動商品化，20世紀40年代即開始對GOD的純化。GOD分子質量為130～175 ku，其純化過程應用到了沉淀法、超濾、層析法[32]。1964年，PAZURJH等[33]通過硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素層析純化到黑曲霉（A.niger）GOD，研究了該酶對不同底物的催化速率，對不同能力做了解釋。近年，超濾因不會對酶造成破壞，酶回收率高等優點受到重視。繩狀青霉（P.funiculosum）46分泌兩種GOD，SEMASHKO T V等[34]開發了一種超濾膜分離法對兩種GOD進行純化。發酵液離心后經0.2μm尼龍膜過濾，分別使用截留分子質量為100 ku、50 ku和20 ku的超濾膜超濾，最終GOD濃度占起始濃度的90%，比活914～956 IU，純化效果理想。目前國內生產的GOD存在嚴重的純度不高問題，使用的GOD主要依賴于進口，價格昂貴，GOD的純化仍是我國未來研究的重點。

4 GOD的應用

20世紀40年代國外開始出現GOD產品，到70年代對GOD的應用已十分普遍。我國緊跟市場需求，1960年，河南省輕化工業廳研究設計院將GOD應用于蛋品加工，1966年，中科院微生物研究所將篩選的GOD優良菌株投入生產，用于干蛋白片加工、尿糖試紙生產及實驗室分析。1999年，GOD被我國農業部列入允許使用的飼料添加劑，用于維持畜禽腸道菌群、抑制霉菌生長、降解毒素等[35]。進入21世紀后，隨著個體化醫療的加快，使得葡萄糖檢測傳感器成為研究熱點。現今，傳感器生產已成為GOD應用研究的主要領域，國內外研究數量顯示，我國在該方面取得豐碩成果。

4.1 在醫藥行業中的應用

糖尿病是世界第三大疾病，血糖的檢測是病情護理的重要部分。從1962年首次提出GOD電極概念至今，GOD傳感器已發展至第三代，成為檢測葡萄糖的主要工具[36]。GOD傳感器以GOD特異催化葡萄糖為基礎，通過檢測GOD上電子的變化來測定溶液中葡萄糖濃度，也可通過熒光檢測GOD分子中黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的變化來作用。何順珍等[37]利用GOD與羅丹明6G建立了一種測定恒量葡萄糖的新型熒光猝滅法，用于血糖測定，操作簡便，結果可靠。近年，多種納米材料被用于固定GOD以改善傳感器功能。WUC等[38]研制出一種納米多孔金固定化的GOD電極，對葡萄糖有很高的敏感性，對膽固醇，三丁酸甘油酯、抗壞血酸等有很強的抗干擾能力，使用壽命長，用于人血清葡萄糖檢測，結果與全自動分析儀一致。另外，GOD催化產生的葡萄糖酸可用于生產葡萄糖酸鹽類保健品。

4.2 在食品行業中的應用

傳統食品加工中通常使用化學添加劑保持食品新鮮、延長貨架期，但其使用不當會對人體造成危害。GOD作為食品添加劑，能夠分解葡萄糖，防止食品氧化并有抑菌作用。1998年，VEMULAPALLIV等[39]將GOD加入面團，發現產生的H2O2使面團更有彈性，黏性更大，開創了GOD作為食品添加劑的應用。VALENCIA PL等[40]在紅酒釀造中使用GOD/過氧化氫酶（catalase，CAT）酶系統，降低了葡萄糖的濃度，生產出低酒精度紅酒，抑制了腐敗菌的生長。食物中添加GOD，還可防止美拉德反應的發生，避免食物褐化和保持食品風味。此外，南美白對蝦經GOD處理后于4℃貯藏120 h，色澤、氣味、咀嚼性、彈性等品質指標都顯著優于對照組[41]，表明GOD有一定的保鮮作用。

4.3 開發生物燃料

能源危機和環境污染問題日益嚴重，使得以酶為主體的燃料電池開發受到廣泛關注。GOD用于生物燃料生產已取得卓越成果。鄒瓊等[42]利用E-TEK Pt/C陰極和新型燃料電池陽極（GOD/CNTs-β-CD-Fc/GC）構建了燃料電池，最大功率密度（33μW/cm，0.18 V），連續工作9 h，仍有92%開路電位，穩定性好，為燃料電池設計提供了新思路。

4.4 在其他方面的應用

在其他方面，GOD也發揮著重要作用。作為飼料添加劑，具有除氧、產酸、排除毒素、抑菌和維持腸道微生態平衡等獨特作用[43]。我國在這方面研究較多，取得了豐碩成果。侯振平等[44]在斷奶仔豬飼料中添加180 U/kg GOD后，相比對照組，仔豬對干物質和粗蛋白的消化率顯著提高，腹瀉率顯著降低，提高了仔豬生長性能。除此之外，GOD催化產生的H2O2可用于漂白織物。GOD具有很大的應用潛力，開發催化效率高、穩定性強的GOD在實際的應用中至關重要。

5 展望

目前國內外報道的GOD酶活普遍較低，不利于工業化生產。海洋資源的開發，為尋找高活性GOD提供了新途徑。研究人員也在不斷努力優化發酵過程和純化步驟，提高GOD的產量，降低生產成本。此外，隨著生物和其他學科技術的發展，提高GOD的異源表達水平，對酶進行修飾改善活性，擴大GOD的應用領域，深入酶的應用機理研究也將是今后的發展方向。

參考文獻：

[1]GAOZ W,LIZF,ZHANGY H,et al.High-level expression of the Penicillium notatum glucoseoxidasegenein Pichiapastoris using codon optimization[J].Biotechnol Lett,2012,34(3)：507-514.

[2]YIN B,YUAN R,CHAI YQ,et al.Amperometric glucose biosensors based on layer-by-layer assembly of chitosan and glucose oxidase on the Prussian blue-modified gold electrode[J].Biotechnol Lett,2008,30(2)：317-322.

[3]MALHERBE D F,TOIT M D,OTERO R R C,et al.Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production[J].Appl Microbiol Biot,2003,61(5-6)：502-511.

[4]宋榮斌，朱俊杰.酶生物燃料電池自供能傳感器的研究現狀及應用[J].分析科學學報，2017，33（5）：686-690.

[5]侯振平，蔣桂韜，李 闖，等.不同葡萄糖氧化酶對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標及養分消化率的影響[J].中國飼料，2017（23）：25-28.

[6]賀 璐，龍承星，劉又嘉，等.微生物乳糖酶研究進展[J].食品與發酵工業，2017，43（6）：268-273.

[7]BODADERG,KHOBRAGADECN,ARFEENS.Optimizationof culture conditionsfor glucose oxidase production by a Penicillium chrysogenum SRT 19 strain[J].Eng Life Sci,2010,10(1)：35-39.

[8]BANKAR SB,BULE M V,SINGHAL R K,et al.Glucose oxidase-an overview[J].Biotechnol Adv,2009,27(4)：489-501.

[9]DUBEY M K,ZEHRA A,AAMIRM,et al.Improvement strategies,cost effective production,and potential applicationsof fungal glucose oxidase(GOD)：current updates[J].Front Microbiol,2017,8(8)：1032.

[10]雷湘南，沈 微，樊 游，等.產葡萄糖氧化酶細菌的篩選和鑒定[C]//中國微生物學會微生物資源專業委員會、國家微生物資源平臺.第五屆全國微生物資源學術暨國家微生物資源平臺運行服務研討會論文摘要集.中國微生物學會微生物資源專業委員會、國家微生物資源平臺，2013：137-143.

[11]MULLER D.Oxidation von glukose mit extrakten aus Aspegillus niger[J].Biochem Z,1928,199(1)：136-170.

[12]KEILIN D,HARTREEEF.Properties of glucose oxidase(notatin)[J].Biochem J,1948,42(2)：221-229.

[13]FARID M A,GHONEIMY E A,El-KHAWAGA M A,et al.Statistical optimizationof glucoseoxidaseproductionfrom Aspergillusniger NRC9 under submerged fermentation using response surface methodology[J].Ann Microbiol,2013,63(2)：523-531.

[14]KRIAA M,HAMMAMII,SAHNOUN M,et al.Purification,biochemical characterization and antifungal activity of a novel Aspergillus tubingensis glucoseoxidasesteady on broad rangeof pH and temperatures[J].Bioprocess Biosystem Eng,2015,38(11)：2155-2166.

[15]YUIVARY,BARAHONA S,ALCAINOJ,et al.Biochemical and thermodynamical characterization of glucose oxidase,invertase,and alkalinephosphatasesecreted by antarctic yeasts[J].Front Mol Biosci,2017,4(1)：86.

[16]葡萄糖氧化酶協作組.點青霉（Penicillium notatum）AS3.3871葡萄糖氧化酶的研究[J].微生物學通報，1974，1（1）：1-5.

[17]朱運平，褚文丹，李秀婷，等.產胞外葡萄糖氧化酶菌株的分離鑒定及其誘變育種研究[J].中國食品學報，2014，14（4）：96-103.

[18]GU L,ZHANG J,LIU B H,et al.High-level extracellular production of glucoseoxidaseby recombinant Pichiapastoris usingacombined strategy[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,175(3)：1429-1447.

[19]石淑鈺，張慶芳，遲乃玉，等.一株海洋低溫葡萄糖氧化酶菌株的篩選、鑒定及部分酶學性質[J].微生物學通報，2014，41（5）：832-838.

[20]SHAIKHS,TRIVEDIR.Cloning&expression of glucoseoxidasefrom Aspergillusniger[J].Int J Pharm Biol Sci,2016,265(7)：685-688.

[21]劉曉筱.黑曲霉葡萄糖氧化酶在解脂耶氏酵母中的表達[D].無錫：江南大學，2016.

[22]GEISENR.Expression of the Aspergillusniger glucoseoxidase genein Penicillium nalgiovense[J].World J Microbiol Biot,1995,11(3)：322-325.

[23]PAPPT,VELAYOSA,BARTOK T,et al.Heterologous expression of astaxanthin biosynthesisgenesin Mucor circinelloides[J].Appl Microbiol Biot,2006,69：526-531.

[24]KAPAT A,JUNGJ,PARK Y H.Improvement of extracellular recombinant glucose oxidase production in fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae：Effect of different feeding strategies[J].Biotechnol Lett,1998,20(3)：319-23.

[25]COURJEAN O,MANO N.Recombinant glucose oxidase from Penicillium amagasakiense for efficient bioelectrochemical applications in physiological conditions[J].J Biotechnol,2011,151(1)：122-129.

[26]陳 楠，肖成建，范新蕾，等.黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母SMD1168 中的表達[J].食品與生物技術學報，2017，36（9）：975-981.

[27]辛國芹，董佩佩，汪祥燕，等.產葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩定性研究[J].中國釀造，2016，35（11）：69-72.

[28]KONA RP,QURESHIN,PAIJS.Production of glucoseoxidaseusing Aspergillusniger and corn steep liquor[J].Bioresource Technol,2001,78(2)：123-126.

[29]郭云瑕，孫鈺婷，辛 穎，等.葡萄糖氧化酶產生菌的紫外誘變及發酵條件優化[J].食品科技，2016，41（5）：2-6.

[30]PETRUCCIOLI M,FENICEENICE M,PICCIONI P,et al.Effect of stirrer speed and buffering agents on the production of glucode oxidase and catalase by Penicillium variabile(P16)in benchtop bioreactor[J].Enzyme Microbial Technol,1995,17(4)：336-339.

[31]SONGH T,XIAOWJ,YANGY M,et al.Improving theanti-oxidation of glucoseoxidasewith computer-aided structureoptimization[J].J Adv Biotechnol,2016,5(3)：736-740.

[32]ZIA M A,RIAZ A RASUL S,ABBASRZ.Evaluation of antimicrobial activity of glucoseoxidasefrom Aspergillusniger EBLAand Penicillium notatum[J].Brazil Arch Biol Tech,2013,56(6)：956-961.

[33]PAZUR J H,KLEPPE K.The oxidation of glucose and related compoundsby glucoseoxidasefrom Aspergillusniger[J].Biochemistry,1964,3(4)：578.

[34]SEMASHKO T V,MIKHAILOVA R V,EREMIN A N.Extracellular glucose oxidase of Penicillium funiculosum 46.1[J].Appl Biochem Microbiol,2003,39(4)：368-374.

[35]張谷楠.黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母和黑曲霉中的分泌表達[D].哈爾濱：東北農業大學，2012.

[36]孫 凱，周 華，楊膺琨，等.血糖監測系統的研究進展[J].中國激光，2018，45（2）：0207003.

[37]何順珍，李菲菲，陸一松，等.酶催化熒光猝滅法測定痕量葡萄糖[J].應用化工，2017，46（12）：1-8.

[38]WU C,SUN H H,LI Y F,et al.Biosensor based on glucose oxidasenanoporousgold co-catalysisfor glucosedetection[J].Biosens Bioelectr,2015,66(1)：350-355.

[39]VEMULAPALL V,MILLERK A,HOSENEY RC.Glucose oxidase in breadmaking systems[J].Cereal Chem,1998,75(4)：439-442.

[40]VALENCIA PL,ESPINOZA K,RAMIREZC,etal.Technical feasibility of glucoseoxidase as aprefermentation treatment for lowering the alcoholic degreeof red wine[J].Am J Enol Viticult,2017,68(3)：386-389.

[41]徐德峰，葉日英，李彩虹，等.Bacillus sp.CAMT22370源葡萄糖氧化酶對南美白對蝦貯藏性能的影響[J].食品科學，2017，38（21）：259-264.

[42]鄒 瓊，劉 娟，朱剛兵，等.一種新型酶生物燃料電池陽極構建及性能研究[J].化學學報，2013，71（8）：1154-1160.

[43]于會民，王瑞生，陳寶江，等.葡萄糖氧化酶及糞腸球菌對肉仔雞生長性能、血液抗氧化指標及養分表觀消化率的影響[J].中國畜牧雜志，2016，52（23）：60-64.

[44]侯振平，蔣桂韜，吳端欽，等.葡萄糖氧化酶對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標和抗氧化功能及養分消化率的影響[J].動物營養學報，2017，29（10）：3482-3488.