響應面法優化異常畢赤酵母（Pichiaanomala）0732-1抑菌產物發酵條件

馬小莉，王曉東*

（石河子大學 農學院 綠洲農作物病害防控重點實驗室，新疆 石河子 832000）

異常畢赤酵母（Pichiaanomala）為子囊菌門異宗配合的酵母，單細胞，屬于非釀酒酵母，其分布十分廣泛。P.anomala的生長溫度范圍在3～37℃、pH范圍為2～12，可以耐受低pH值、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環境[1]。基于以上原因，P.anomala以其獨有的生理特性及作為一種對人類、環境安全的拮抗微生物而廣泛應用在生物防治中。

瓜類細菌性果斑病是發生在葫蘆科植物上的一種嚴重的檢疫性病害，是一種具有高度破壞性的種傳病害，其病原菌為瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli）（Aac），可以侵染多種葫蘆科作物如西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜等[2-4]。目前，生產上對該病害的防治主要采用化學防治方法。但據研究顯示，生產上常用的化學藥劑對細菌性果斑病的防治效果都不理想[5]。頻繁使用化學殺菌劑，不僅易使病菌產生抗藥性，而且影響環境安全和人體健康。然而，生物防治具有無污染、無公害、不產生抗藥性，長效等優點，因此，在農業和經濟發展方面，利用P.anomala 0732-1對病害進行生物防治具有重要意義。WANGX D等[6]研究發現，P.anomala 0732-1對哈密瓜細菌性果斑病具有良好生防效果，并發現該菌株能產生對病原具有抗生作用的有機酸類物質。據陳好娟[7]研究發現，通過不同檢測方法明確P.anomala 0732-1上清液中抑菌物質的主要組分有：乙酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸。乙酸含量最高，其次為琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸，丙酸含量最少。

目前，有關P.anomala0732-1發酵條件及抑菌效果的研究尚處起步階段，國內外暫無相關研究結果。在課題組前期完成了培養基優化和單因素試驗基礎上，本試驗對P.anomala 0732-1抑菌產物發酵條件進行優化研究，并對其產物進行抑菌效果測定，以期為后期規模化發酵生產及其實踐應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

異常畢赤酵母（Pichia anomala）0732-1和瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli）XJ05-1（Aac）由石河子大學農學院植保系王曉東提供。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、金氏培養基B（King's B agar，KBA）：參照文獻[8]制備；優化培養基：參照文獻[7]制備。

1.2 儀器與設備

UV-1600紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；ZWY-211B型恒溫振動搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；MLS-3750型高壓滅菌器：日本三洋公司；FE20型pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；5417R型臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SW-CJ-1C型超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；XB.K.25型紐鮑爾血球計數板：上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化制備

異常畢赤酵母（P.anomala）0732-1活化：用接種環挑取試管中保存的酵母菌株劃線（接種方式）于PDA平板上，經28℃活化36 h。用無菌水清洗菌苔，洗液裝入2 mL離心管，4℃、10 000 r/min離心5 min，重復2次，借助紐鮑爾血球計數板配制濃度為1×108CFU/mL的酵母懸浮液，備用。

瓜類果斑病菌（A.citrulli）XJ05-1（Aac）活化：Aac在KBA平板上于28℃活化48 h，用無菌水清洗菌苔，菌液裝入2 mL離心管，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，重復2次，用無菌水懸浮菌體，借助紫外-可見分光光度計將菌懸液的濃度調整到1×108CFU/mL（OD600nm值=0.3～0.4），備用。

1.3.2 抗菌物質抑菌效果的測定

P.anomala0732-1所產生短鏈有機酸是其生防機制的關鍵因子，采用瓊脂孔擴散法測定抑菌圈直徑[9]。吸取1 mL濃度為1×108CFU/mL（OD600nm=0.3～0.4）的Aac菌懸液加入KBA平板，使Aac菌懸液布滿全皿，吸出多余菌液，無菌條件下，晾干培養基表面的水分。用直徑為7 mm無菌打孔器打孔，吸取100μL樣品注入孔中，將培養皿置于28℃恒溫生化培養箱中培養48 h后，用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，每個處理3次重復。

1.3.3 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman（PB）試驗設計廣泛用于因素主效應的估計[10]，是一種近飽和的二水平試驗設計方法，能以最少試驗次數快速篩選出對應變量影響顯著的幾個因素，以供進一步研究。本試驗選取5個影響因素作為研究對象，PB試驗設計表選用5因素，N=12次的試驗表格，每組試驗做3個平行，取平均值。分析試驗結果，比較各因素對酵母菌抑菌效果的影響。具體試驗因素和水平參見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 最陡爬坡試驗設計

在響應面設計中，為建立有效的響應面擬合方程，使所選各個因素的水平必須逼近最大抑菌區域，因此，必須進行最陡爬坡試驗[11]。根據PB試驗結果中各個顯著影響因素效應的大小來設定步長及變化方向，找出峰值，快速逼近最佳值區域。

1.3.5 BBD試驗設計

通過最陡爬坡試驗逼近最佳范圍后，采用響應面分析法中Box-Behnken設計（Box-Behnken Design，BBD）法[12-13]，對其關鍵因子進行深入研究。根據爬坡試驗結果，利用Design Expert 8.0.6軟件對主要影響因素進行3因素3水平響應面分析設計。每個試驗重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 PB試驗篩選主要影響因子

在前期試驗室相關研究成果的基礎上，選用試驗次數N=12的PB試驗設計對培養液初始pH值、接種量、溫度、培養時間和裝樣量（150 mL三角瓶）5個因素進行考察，表1中X1、X2、X4、X5、X7分別代表培養液初始pH值、接種量（%）、溫度（℃）、培養時間（h）和裝樣量（mL/mL），并設X3、X6、X8三個空白作為誤差分析項。每個因素取高低兩個水平，高水平為低水平的1.5倍，每組試驗設計3次重復來測定抑菌圈直徑。PB試驗設計及響應值及結果見表2。運用Design Expert 8.0.6軟件對各個因素進行分析，選出顯著因素進行進一步分析。

利用Design Expert 8.0.6軟件對PB試驗結果進行方差分析，結果見表3。由表3可知，對抑菌效果有顯著影響的因素包括培養液初始pH值、溫度、裝樣量，因此，選取這3個因素作為顯著影響因素進行最陡爬坡試驗。其中培養液初始pH值和裝樣量具有正效應，溫度具有負效應。

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗設計的因素水平及主效應分析Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design and main effects analysis

2.2 最陡爬坡試驗

爬坡試驗的目的在于選出最佳水解度范圍作為響應面試驗因素水平的中心點進行響應面試驗設計[14]。根據表3各因素對酵母菌抑菌效果影響從大到小為：培養液初始pH值＞裝樣量＞培養溫度。由于培養液初始pH值和裝樣量具有正效應，培養溫度具有負效應，可以確定爬坡方向并選擇合理步長（培養液初始pH值正向增加0.5，裝樣量正向增加5 mL，溫度減少0.5℃），每個試驗重復3次，取平均值。試驗設計和結果如表4所示。由表4可知，抑菌圈最大響應值在第3組與第5組試驗之間，因此，以第4組試驗條件為后續試驗中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 響應面分析法優化結果

經爬坡試驗得出Box-Behnken試驗的中心點，選擇3因素3水平進行試驗設計[15-16]，對培養液初始pH（A）、培養溫度（B）、裝樣量（C）進行研究，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，分別以-1、0、1編碼，響應面試驗因素與水平見表5，Box-Behnken試驗設計及結果見表6。

表5 響應面分析試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design Expert 8.0.6軟件響應面分析程序對15組試驗的響應值進行回歸分析，經過回歸方程擬合，得到各個試驗因子的回歸方程為：

回歸方程的方差分析結果見表7。由表7可知，P＜0.01，失擬項P值＞F值＞0.05，說明回歸模型顯著極顯著，失擬檢驗不顯著（P＞0.05），即該模型在所研究區域內擬合性較好。回歸方程的決定系數R2=0.952 1，表明實際試驗與預測值具有高度相關性，該模型可信度高，可以對發酵產物的抑菌效果進行預測。一次項A影響達到極顯著水平（P＜0.01），B、C影響不顯著（P＞0.05）；交互項AB影響達到極顯著水平（P＜0.01），AC、BC影響不顯著（P＞0.05）；二次項A2、C2影響達到極顯著水平（P＜0.01），B2影響顯著（P＜0.05）。表明各因素對抗菌效果影響的影響不是簡單的線性關系。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4 響應曲面分析

培養液初始pH與溫度交互作用對抑菌圈直徑影響的響應面及等高線圖見圖1。由圖1可知，隨著溫度和培養液初始pH不斷增大，抑菌圈直徑先上升后下降，說明這兩者過大或過小都不能使抑菌圈直徑達到最大值，只有當它們取某個適中值時，抑菌圈直徑才可達到最大值。通過軟件進一步分析計算，預測最大抑菌圈直徑為18.4 mm，此時培養液pH為9.44，培養溫度為25℃，裝樣量為61.06 mL/150 mL。

圖1 培養液初始pH值和培養溫度交互作用對抑菌圈直徑影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH value of culture medium and culture temperature on the inhibition zone diameter

2.5 驗證試驗

通過Design Expert8.0.6軟件得到的最優發酵條件為培養液初始pH 9.44、培養溫度25℃、裝樣量61.06 mL/150 mL。為驗證模型的準確性和有效性，對預測的最佳發酵條件和初始發酵條件分別進行搖瓶發酵試驗，平行試驗3次，結果取平均值。為方便實際操作修改條件為培養液初始pH 9.4、培養溫度25℃、裝樣量61 mL/150 mL、接種量8%、培養時間60 h。回歸方程所得出的最高產量的預測值18.4 mm與驗證試驗的平均值17.9mm接近，抑菌圈直徑比優化前（13.5mm）提高了32.6%。

3 結論

在試驗室前期試驗的基礎上，以異常畢赤酵母（Pichia anomala）0732-1為試材試，利用響應面法優化異常畢赤酵母0732-1抑菌產物發酵條件，得到最佳發酵條件：培養液初始pH 9.4、培養溫度25℃、裝樣量61 mL/150 mL、接種量8%、培養時間60 h。經響應面優化及驗證試驗得到最大抑菌圈直徑17.9 mm，較優化前抑菌效果提高32.6%，為后續酵母菌的生產應用奠定了基礎。

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