植物乳桿菌和釀酒酵母發酵菠蘿汁的性能比較及產物分析

馬立娟，王 超，杜麗平*，韓曉霞，孫 文，李大雷，郭高杰

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

隨著經濟的發展和社會的進步，人們對日常飲食的營養價值與保健功能提出了更高的要求。益生菌不僅具有促進食物消化吸收等功能，而且對糖尿病等慢性病還具有一定的預防功能，因此，益生菌產品日益受到人們的關注[1]，與益生菌相關的食品和飲料產品在國際市場中種類越來越多，份額越來越大[2-3]。除占市場份額最大的益生菌發酵乳制品以外，目前以谷物、果蔬汁等不同原料作為發酵載體進行益生菌發酵的研究與相關產品日趨增多[4]。

果蔬具有低蛋白、低脂肪的特點，含有大量的礦物質與豐富的維生素，具有天然的令人愉悅的口感風味。將果蔬汁進行益生菌發酵是一種優良的加工方式，相關研究也日趨增多。YOON K Y等[5]采用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）A4、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C3和德式乳酸桿菌（Lactobacillusdelbrueckii）D7發酵甘藍汁，獲得了含有大量活菌并且具有緩解乳糖不耐癥功能的發酵甘藍汁。FILANNINO P等[6]采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵石榴汁，開發健康功效與口感風味俱佳的益生菌產品。菠蘿又名鳳梨，是熱帶、亞熱帶特產水果之一，在我國水果市場占有重要地位。菠蘿含有豐富的糖、蛋白質、維生素C（vitamin C，VC）、β-胡蘿卜素、膳食纖維以及鈣、鉀、鎂等礦物質，具有利尿、解熱解暑、解酒、降血壓、預防便秘和抗癌等功效[7-8]。菠蘿香氣誘人、風味獨特，菠蘿經益生菌發酵會產生使人愉悅的酒香和果香[9]。潘詠梅[10]通過氣質聯用色譜定性及氣相色譜定量方法對菠蘿鮮汁及菠蘿加熱汁、菠蘿發酵汁中揮發性風味物質的變化進行了總體分析。朱龍寶等[11]研究發現，在菠蘿汁澄清處理過程中會引起菠蘿汁組成成分的變化，對發酵過程和菠蘿酒酯類等風味物質均產生較大的影響。目前以釀酒酵母發酵生產菠蘿汁飲料的研究報道較多，但采用植物乳桿菌單獨或其與釀酒酵母混菌發酵的還少見相關報道。

本研究采用新鮮的菠蘿汁為原料，利用本實驗室從水果發酵體系中篩選得到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分別進行單菌與混菌發酵，對不同接菌方式發酵菠蘿汁的益生菌活菌數、酸度、糖、氨基酸態氮、有機酸以及風味物質進行比較分析，為高品質菠蘿發酵飲品的研制提供技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）均由本實驗室篩選獲得。

1.1.2 實驗原料

新鮮菠蘿（食品級）：市售。

1.1.3 化學試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂粉（均為生化試劑），葡萄糖、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、氯霉素、吐溫80（均為分析純）：天津市英博生化試劑有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖（純度＞98%）：南京化學試劑股份有限公司；甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸（純度＞98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.3.4 培養基

酸化MRS培養基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸二胺2 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫80 1 mL，溶解于1 000 mL蒸餾水中，攪拌均勻，分裝到三角瓶，121℃濕熱滅菌15 min（固體培養基添加2%瓊脂粉后滅菌）。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，攪拌均勻，分裝到三角瓶，121℃濕熱滅菌15 min（固體培養基添加2%瓊脂粉后滅菌）。

酵母粉浸出粉葡萄糖氯霉素（yeast extract dextrose chloramphenicol，YEDC）培養基：酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，攪拌均勻，分裝到三角瓶，121℃濕熱滅菌15 min（固體培養基添加2%瓊脂粉后滅菌）。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1115B型超凈工作臺、2XJD-A1270型電熱恒溫培養箱：鄭州南北儀器設備有限公司；IS-RDS3疊加式恒溫振蕩器：河南兄弟儀器設備有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司設備廠；HWS24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；pHS-3C精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；Centrifuge 5430R離心機：德國艾本德有限公司；HR2874/00榨汁機：荷蘭飛利浦電子有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 7890A-5975CGC/MS氣質聯用色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菠蘿汁的制備

選新鮮的菠蘿，去掉果皮后用清水沖洗，切粒，按照菠蘿∶水=1∶1（g∶g）的比例，將菠蘿與水一同放入榨汁機打漿過濾得到菠蘿汁。將菠蘿汁放入75℃的水浴鍋中，待菠蘿汁升溫至75℃并維持15 min（巴氏消毒法），將菠蘿汁滅菌與滅酶。降溫至40℃左右，待用。

1.3.2 菌種的活化

乳酸菌活化：用接種環從保存菌種的斜面上挑取乳酸菌，接種到裝有10 mL MRS液體培養基的試管中，把試管置于37℃恒溫培養箱中，靜置培養16 h，再將其倒入裝有200 mL MRS液體培養基的三角瓶中，把三角瓶置于37℃恒溫培養箱中，靜置培養20 h。

酵母菌活化：將0.1 g的凍干酵母粉倒入裝有10 mL YEPD液體培養基的試管中，把試管置于30℃、150 r/min振蕩培養12 h，再將其倒入裝有200 mL YEPD液體培養基的三角瓶中，置于30℃、150 r/min振蕩培養24 h。

1.3.3 菠蘿汁發酵

單菌發酵：對活化好的植物乳桿菌和釀酒酵母，分別測定其活菌數，然后以6%的接種量分別接種到滅菌后的菠蘿汁中（3個平行）。37℃密封靜置發酵72 h，發酵結束取樣測定發酵液中活菌數、pH、酸度、氨基氮、葡萄糖、果糖、蔗糖、有機酸、乙醇以及揮發性成分。

混菌發酵：對活化好的且已測定活菌數的植物乳桿菌和釀酒酵母培養液，按照植物乳桿菌接種量為4%，釀酒酵母接種量為2%時接種到滅菌后的菠蘿汁中（3個平行）。37℃密封靜置發酵7 h，發酵結束取樣測定發酵液中活菌數、pH、酸度、氨基氮、葡萄糖、果糖、蔗糖、有機酸、乙醇以及揮發性成分。

1.3.4 分析方法

活菌數測定：取0.1 mL樣液于0.9 mL滅菌水中稀釋，然后用同樣的方法進行梯度稀釋，選3個稀釋度，吸取0.1 mL的液體，進行平板涂布。單菌發酵計數時，植物乳桿菌用MRS培養基平板進行涂布計數，釀酒酵母用YEPD培養基平板進行涂布計數。混菌發酵計數時，酵母菌用YEDC培養基平板進行計數，乳酸菌用添加了放線菌酮的MRS培養基平板進行計數。用于乳酸菌計數的平板置于37℃的培養箱中培養3 d后計數，用于酵母菌計數的平板置于30℃的培養箱中培養3 d后計數，每個梯度涂布3個平行。菌落計數單位為CFU/mL。全程要求無菌操作。

pH測定：pH計測定各樣液pH。

氨基酸態氮含量的測定：參照文獻[12]進行測定。

糖類含量測定：采用高效液相色譜法測定蔗糖、果糖、葡萄糖含量。高效液相色譜檢測條件：Prevail Carbohydrate ES 5u色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相乙腈∶水=75∶25（V/V）；流速為0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測器為蒸發光散射檢測器（evaporativelight scatteringdetector，ELSD）；載氣（氮氣）流量2.2 mL/min；增益1；進樣量10.0μL。

有機酸含量測定：采用高效液相色譜法測定各有機酸（甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸）含量。高效液相色譜檢測條件：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）；流動相5 mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；柱溫60 ℃；檢測器為可變波長檢測器（variablewavelength detector，VWD）；波長210 nm；進樣量20μL。

香氣物質測定：用氣質聯用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）方法測定揮發性香氣物質。氣相色譜檢測條件：HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣溫度250℃；分流進樣，分流比20∶1；程序升溫：初始45℃（保留2 min），3.5℃/min升至220℃（保留2 min）；載氣流量1.0 mL/min。質譜檢測條件：離子源：電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；發射電流：34.6μA；接口溫度：280℃；掃描質量范圍：30～550 amu。

2 結果與分析

2.1 不同接菌方式對活菌數的影響

表1 菠蘿汁發酵前后總活菌數的比較Table 1 Comparison of total viable count before and after pineapple juice fermentation

取已滅菌的菠蘿汁，分別接入植物乳桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌∶釀酒酵母（2∶1）（活菌數約為6×106CFU/mL），37℃靜置發酵72 h后，發酵結束分別對發酵液中的活菌進行計數，結果如表1所示。

由表1可知，相同接種量的條件下，植物乳桿菌單獨發酵菠蘿汁72 h后活菌數最多，可達2×108CFU/mL，是釀酒酵母單獨發酵的3倍多，約為二者混合發酵總活菌數的10倍，二者單獨發酵最終總活菌數均高于混合發酵的總活菌數。賈磊等[13]研究表明，通常情況下，酵母菌與乳酸菌之間不會表現出特別明顯的促進或抑制關系，但某些特定的乳酸菌與某些特定的酵母菌之間會有一定程度上的促進或抑制關系。BROOMEM C等[14]研究表明，酵母菌生長過程中會代謝產生脂肪酸等一些抑制乳酸菌生長代謝的物質，同時，乳酸菌在生長過程中會產生苯乳酸等一些抑制酵母菌生長代謝的物質[15]，這可能是本研究中植物乳桿菌與釀酒酵母混合發酵總活菌數降低的原因。

2.2 不同接菌方式對發酵液pH和滴定酸度的影響

不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后的pH值和滴定酸度檢測結果見表2。

表2 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后pH值和滴定酸度檢測結果Table 2 Determination results of pH value and titratable acidity of pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h

由表2可知，未接菌的菠蘿汁初始pH值最高，為3.81，滴定酸度最低，為70°T，無論是單菌還是混菌發酵，pH值均有所降低，滴定酸度均明顯升高。單獨接入釀酒酵母發酵72 h后，菠蘿汁pH值（3.78）和滴定酸度（74°T）變化不明顯；而單獨接入植物乳桿菌發酵72h后的菠蘿汁，pH值最低（3.21），滴定酸度最高（168°T）；混菌發酵72 h后的菠蘿汁pH值（3.57）變化不大，滴定酸度有所提高（98°T）。這是由于乳酸菌通常在密封缺氧條件下利用葡萄糖等碳水化合物產生乳酸等有機酸物質，從而引起pH降低；而酵母菌在無氧環境下利用葡萄糖等碳水化合物主要生成CO2與乙醇等，對pH值沒有明顯影響。

2.3 不同接菌方式發酵體系中底物的消耗的比較

2.3.1 氨基酸態氮的消耗

不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后發酵液中氨基酸態氮含量檢測結果見圖1。

由圖1可知，菠蘿汁的氨基酸態氮含量為7.56×10-4mg/L，與之相比，接入植物乳桿菌單獨發酵72 h后菠蘿汁中氨基酸態氮的含量為7.84×10-4mg/L，含量沒有明顯變化，而接入釀酒酵母發酵72 h后菠蘿汁中氨基酸態氮的含量為3.15×10-4mg/L，含量明顯降低，其中，植物乳桿菌與釀酒酵母混菌發酵的氨基酸態氮含量最低（2.92×10-4mg/L）。林樸[16]實驗表明，酵母菌發酵第1～2天內可迅速并大量利用氨基酸態氮，本實驗所得結果與其基本一致。此外，植物乳桿菌∶釀酒酵母（2∶1）混合發酵（2.66×10-4mg/L）時菠蘿汁中的氨基酸態氮含量比釀酒酵母單獨發酵（3.15×10-4mg/L）時略低，可見植物乳桿菌與酵母菌混菌發酵在氨基酸態氮利用方面有微弱的促進作用。

圖1 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后的氨基酸態氮含量檢測結果Fig.1 Determination results of amino nitrogen contents in pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h

2.3.2 糖類物質的消耗

不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后發酵液中糖類物質含量的檢測結果見表3。

表3 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后糖類物質含量檢測結果Table 3 Determination results of carbohydrates contents in pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h g/L

由表3可知，未接菌的菠蘿汁與菠蘿汁發酵液中均未檢測到木糖與乳糖。菠蘿汁中蔗糖、果糖和葡萄糖的含量分別為180.81 g/L、93.42 g/L和11.22 g/L。發酵72 h后，菠蘿汁中的蔗糖、果糖與葡萄糖的含量均有不同程度的減少，其中，接入釀酒酵母發酵后的菠蘿汁中的這三種糖已基本被消耗完，而單獨接入植物乳桿菌發酵72 h后的菠蘿汁中蔗糖、果糖和葡萄糖的殘余量分別為87.91 g/L、6.47 g/L和46.51 g/L。由此可見，釀酒酵母對這三種糖的利用能力非常強，幾乎可以完全把菠蘿汁中的糖消耗殆盡；而植物乳桿菌對這三種糖有一定的消耗能力，但比釀酒酵母小很多。

2.4 不同接菌方式發酵體系中產物分析

2.4.1 有機酸

食品中有機酸的作用是非常重要的，首先有機酸具有一定的抑制致病菌的能力[17]。并且有機酸對人維持自身身體健康也有很大作用。本實驗對不同接菌方式的菠蘿汁發酵72 h后進行各種有機酸進行定量分析[18]，測定結果見圖2。

圖2 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后有機酸含量檢測結果Fig.2 Determination results of organic acids contents in pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h

由圖2可知，菠蘿汁與菠蘿汁發酵液中，沒有檢測到酒石酸與丁酸。菠蘿汁中含有一定量蘋果酸（1892.77mg/L）、甲酸（486.78mg/L）、乳酸（200.27mg/L）、琥珀酸（1147.96mg/L）、乙酸（1 070.48 mg/L）、丙酸（1 836.93 mg/L）。發酵后，菠蘿汁中除酒石酸與丁酸，其余各種有機酸的含量相較于發酵前都有一定程度的變化。

發酵后菠蘿汁與未發酵菠蘿汁的有機酸組成出現了差異，這將構成發酵后菠蘿汁與未發酵菠蘿汁之間的口感差異，同時，各種發酵菠蘿汁之間的有機酸組成也存在著明顯的差異，這也是各發酵菠蘿汁形成自己獨特的口感的原因。植物乳桿菌單獨發酵的乳酸產量很高，酵母的加入可以降低乳酸的含量；釀酒酵母會產生甲酸，而植物乳桿菌的加入會抑制甲酸的產生；兩種菌的加入都會降低琥珀酸和蘋果酸的含量。這些有機酸也是良好的抑菌劑、防腐劑，有機酸的增加或減少關系著發酵菠蘿汁的貨架期。

2.4.2 乙醇

乙醇是含醇飲料中極為常見的組成成分。乙醇的含量關系著飲料的口感，對于發酵飲料來說，適量的乙醇將有助于延長發酵飲料的貨架期。實驗中分別對不同接菌方式的菠蘿汁發酵72h后進行乙醇含量的檢測，檢測結果如圖3所示。

圖3 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后乙醇含量檢測結果Fig.3 Determination results of ethanol contents in pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h

由圖3可知，菠蘿汁中與單獨接入植物乳桿菌發酵72 h的菠蘿汁中乙醇的含量幾乎為零，由于植物乳桿菌主要進行乳酸發酵，僅當進行異型乳酸發酵時可能生成少量的乙醇。而接入釀酒酵母及混菌發酵72 h，菠蘿汁中乙醇的含量分別為17.03 g/L和15.28 g/L，含量明顯增加這是因為釀酒酵母主要進行的是乙醇發酵。

2.4.3 香氣物質

不同接菌方式的菠蘿汁發酵72 h后的香氣物質成分檢測結果見表4。

表4 不同接菌方式菠蘿汁發酵72 h后香氣物質檢測結果Table 4 Determination results of aroma compounds contents in pineapple juice fermented by different inoculation ways for 72 h

續表

由表3可知，菠蘿汁原料中可檢測到的香氣物質有11種（己酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、庚酸甲酯、3-甲硫基丙酸甲酯、（Z）-辛烯酸甲酯、己酸乙酯、4-癸烯酸甲酯、丁酸甲酯、α-蒎烯）。其中，己酸甲酯、3-甲硫基丙酸甲酯、己酸乙酯、丁酸甲酯具有菠蘿味香氣，2-甲基丁酸甲酯和辛酸甲酯具有獨特的果香，α-蒎烯具有獨特香氣，庚酸甲酯常用于香料的合成。因此，在發酵過程中盡可能保留這幾種香氣成分，有助于保存菠蘿的獨特風味。經過對比，用植物乳桿菌單菌發酵的菠蘿汁香氣成分有9種，菠蘿的主要香氣物質基本得以保留，也有原料中不存在的物質生產如萜品烯；而用釀酒酵母進行發酵時菠蘿的主要香氣物質共7種，只有己酸甲酯是菠蘿汁中的成分，其余6種揮發性物質都是新生成的；而植物乳桿菌與釀酒酵母混菌發酵的菠蘿汁香氣成分有16種，菠蘿汁的大部分香氣物質得以保留，新增的香氣物質還起到調節發酵菠蘿汁風味的作用，有助于形成較為獨特的風味。由此可見，采用植物乳桿菌和釀酒酵母進行混合發酵，既可保有菠蘿本身的營養物質和特有香氣，又賦予其一定的發酵風味，獲得口感良好的菠蘿發酵飲品。

3 結論

本研究以菠蘿作為發酵原料，對比了采用植物乳桿菌和釀酒酵母分別進行單菌與混菌發酵時的發酵性能，結果發現，無論單菌還是混菌，均能夠在菠蘿汁生長繁殖并發酵；發酵的菠蘿汁pH均會下降，滴定酸度均升高；混菌發酵時植物乳桿菌和釀酒酵母的生長狀態均不如單菌發酵時，但綜合考慮乳酸、乙醇以及香氣物質的生成情況，采用植物乳桿菌和釀酒酵母進行混合發酵，既可保有菠蘿本身的營養物質和特有香氣，又可賦予其一定的發酵風味，獲得口感良好的菠蘿發酵飲品。

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