兩種木質素對纖維素酶水解的影響機制

吳 凱，應文俊，鄭志鋒，史正軍，楊海艷，楊 靜*

(1.西南林業大學 化學工程學院，云南 昆明 650224；2.云南省生物質高效利用工程實驗室，西南林業大學, 云南 昆明 650224)

受全球能源緊缺和環境惡化所帶來的嚴峻挑戰，以生物質為原料開發新能源和新型化學品的研究越來越受到國內外研究者的關注。木質纖維是世界上最豐富的一種可再生生物質原料，利用其中的纖維素生產和制備乙醇成為了近年來的研究熱點[1]。大量的研究發現，纖維素酶解過程中，木質素是主要抑制劑，一方面，木質纖維原料中的木質素和半纖維素、木質素和纖維素之間復雜的結構構成了纖維素的“天然抗降解屏障”[2-4]；另一方面，木質素對纖維素酶的非生產性吸附將減少纖維素對纖維素酶的有效吸附[5-7]。盡管通過預處理手段可以除去大量木質素，但并不能從根本上解決木質素對纖維素酶水解的抑制。為了解決這個難題，研究人員試圖通過探討木質素在纖維素酶水解中的影響機制找到解決辦法。如Li等[8]在堿木質素對酶蛋白的吸附中發現隨著相對分子質量的遞增，堿木質素對纖維素酶蛋白的親和力和分配系數減小，從而推測木質素分子中可能存在一些功能基團可導致其疏/親水性、電負性等性能改變，最終影響纖維素酶解效率。本研究以云南苦竹為原料，經有機溶劑和球磨預處理制備乙醇木質素(EOL-B)和磨木木質素(MWL-B)，采用FT-IR和13C NMR分析木質素結構，并探究其對纖維素酶解效率、纖維素吸附酶蛋白的影響作用及機制，以期為纖維素酶水解的研究提供理論依據。

1 實 驗

1.1原料、試劑與儀器

苦竹，采自云南省普洱市，粉碎，取0.3～0.45 mm粉末。微晶纖維素(Avicel PH-101)，購自Sigma公司。纖維素酶(UTA-8)，購于湖南尤特爾生化有限公司，濾紙酶活100 FPIU/mL，β-葡萄糖苷酶活72 IU/mL；纖維素酶(C2730)來源于里氏木霉(ATCC 26921)，購自Sigma公司，濾紙酶活128 FPIU/mL，β-葡糖苷酶酶活27 IU/mL。乙醇、甲苯、98 %硫酸、二氧六環，均為分析純。水熱反應器，鄭州博科儀器設備有限公司；球磨機，德國FRITSCH公司；冷凍干燥機，德祥科技有限公司；Agilent 1200 series高效液相色譜儀(HPLC)，美國Agilent公司；紅外吸收光譜儀(Madison, WI)，美國Thermo Nicolet公司。

1.2木質素制備

1.2.1乙醇木質素 參照文獻[9]將20 g苦竹與140 mL 75 %乙醇混合，固液比1∶7(g∶mL)，加入 98 %硫酸0.102 g。將混合液裝入1 L的水熱反應器中，在170 ℃下反應1 h。反應結束后，迅速冷卻反應器，取出反應后的混合物，過濾，濾液中加入3倍的水，將醇溶木質素沉淀，過濾，即得到乙醇木質素(EOL-B)。

1.2.2磨木木質素 參照文獻[10～11],將 30 g 苦竹用甲苯-乙醇抽提6 h, 甲苯200 mL，乙醇100 mL，抽提后的苦竹風干并取 20 g 球磨 8 h，球磨后的樣品15 g 用300 mL 96 %二氧六環常溫避光抽提48 h，固液比為1∶20(g∶mL)，過濾，調節pH值 5.5，將濾液減壓濃縮至 30 mL，將濃縮后的濾液逐滴加入到 90 mL 的 95 %乙醇溶液中沉淀，離心分離半纖維素。將離心后的濾液減壓濃縮5 mL，加入 50 mL 酸(pH值 2.0)，離心，冷凍干燥，即得磨木木質素(MWL-B)。

1.3纖維素酶水解

取微晶纖維素0.4 g，分別加入0、 40、 80、 160 mg 的EOL-B和MWL-B，加入18.6 mL水、1 mL檸檬酸緩沖液和0.4 mL纖維素酶液，酶用量為10 FPIU/g(以葡聚糖計，下同)，總體系20 mL。充分攪拌均勻后，置于(50±1) ℃、 150 r/min的搖床中反應。分別于2、 4、 8、 12、 24、 48和72 h取樣，于3 000 r/min下離心10 min，取1 mL清液適當稀釋后用高效液相色譜測定反應液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計算纖維素酶水解得率[12-13]。纖維素水解葡萄糖得率按式(1)計算：

Y=(c×0.02×0.9)/(m×W)×100 %

(1)

式中：Y—纖維素水解葡萄糖得率，%；0.02—水解糖液體積，L；c—水解液中葡萄糖和纖維二糖質量濃度，g/L；0.9—纖維素和葡萄糖、纖維二糖的轉換系數；m—原料質量，g；W—原料中纖維素質量分數，%。

1.4纖維素酶吸附

分別稱取EOL-B和MWL-B各0.1 g于50 mL三角瓶中，加入一定量的水、0.25 mL檸檬酸緩沖液和纖維素酶液(0.02～0.1 g/L)，使底物質量分數為2 %。充分攪拌均勻后，置于(4±1) ℃、150 r/min的搖床中反應3 h。通過測定上清液中蛋白質含量(Bradford法)來評價不同時間纖維素酶蛋白的吸附情況[14]。蛋白質標準方程：y=1.094 8x-0.562 8，R2=0.994(x為吸光值，y為上層液酶量)。用Langmuir等溫吸附方程擬合不同底物對纖維素酶的吸附性能[13]，其中，Γmax和K值可由Langmuir線性方程擬合得出，分配系數R=Γmax×K。方程如式(2)所示：

Γ=KCΓmax/(1+KC)

(2)

式中：C—上清液中的游離酶質量濃度，g/L；Γ—底物上結合酶的濃度，mg/g；Γmax—纖維素酶在底物上的飽和吸附量，mg/g；K—Langmuir常數，表示纖維素酶的親和力。

1.5分析表征

1.5.1化學組分分析 樣品的纖維素、半纖維素和木質素的組成按美國可再生能源實驗室公布的方法測定[15]。采用HPLC測定酶水解液中的糖組分，酶水解后的上清液經0.45 μm 濾膜過濾后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L 的硫酸作為流動相，流速為0.6 mL/min，在色譜柱溫為55 ℃，示差折光檢測器(RI)上進行檢測。

1.5.2紅外光譜分析 樣品采用紅外吸收光譜儀進行分析，波數范圍400～4000 cm-1，掃描32次和分辨率2 cm-1透射模式下采集數據。

1.5.3核磁共振分析 樣品采用布魯克400 M超導核磁共振儀進行測定。以氘代DMSO為溶劑，在FTr模式100.6 MHz下進行信號采集，選取DMSO的(39.5)進行校標。采樣條件為：采用30度脈沖序列，采樣時間1.36 s，弛豫時間1.89 s，累積30 000次。

2 結果與分析

2.1成分分析

從苦竹中提取的乙醇木質素(EOL-B)和磨木木質素(MWL-B)的主要化學成分如表1所示。

表1 苦竹、乙醇木質素和磨木木質素成分Table 1 Constituent of bitter bamboo, EOL-B and MWL-B

從表1可得出，苦竹含葡聚糖41.2 %，木聚糖22.3 %，木質素30.3 %；經乙醇和球磨處理后得到的EOL-B和MWL-B中木質素質量分數分別為95 %和90.2 %，葡聚糖質量分數均小于8 %，無木聚糖和乙醇抽出物，兩者都具有較高的純度，可作為木質素的模型物用于木質素結構對纖維素酶吸附和酶水解的研究。MWL-B是采用深度球磨和溶劑萃取(二氧六環)分離出的木質素，這種木質素在結構上與原本木質素相近，被廣泛充當原本木質素的模型物來研究木質素的結構。

2.2纖維素酶水解

以磨木木質素(MWL-B)和乙醇木質素(EOL-B)作為模型物，研究木質素對纖維素酶水解的影響。以微晶纖維素和添加了0、 40、 80、 160 mg的EOL-B或MWL-B的微晶纖維素為底物，在纖維素酶用量10 FPIU/g、pH值4.8和50 ℃條件下水解，葡萄糖得率隨時間的變化見圖1。由圖1可知，隨著MWL-B的用量增加，72 h葡萄糖得率從 51.34 %降低至 46.06 %，葡萄糖得率降低了10 %。Sun等[15]研究發現紫丁香基單元和愈創木基單元能對纖維素酶水解產生聯合抑制效應，這主要是由于縮合的芳環增加了木質素分子的疏水性，而紫丁香基和愈創木基提高了木質素的氫鍵結合力，因此對木質纖維素的酶水解過程產生了協同抑制作用。然而，從圖1還可看出，隨著EOL-B的用量增加，葡萄糖72 h得率分別為56.06 %、60.61 %和61.06 %；與對照的葡萄糖得率51.34 %相比，加入8 g/L EOL-B后，72 h葡萄糖得率增加了19 %。Zhou等[16]認為磺酸鹽木質素可能作為一種表面活性劑來提高纖維素的酶水解效率。MWL-B經過球磨、二氧六環抽提制得，而EOL-B為經乙醇萃取，溶解于乙醇溶液中的木質素。不同的預處理方式得到的木質素，化學結構及其表面化學性質也不同，這些變化會影響到纖維素的酶解效率。

2.3木質素對纖維素酶吸附的影響

以微晶纖維素、MWL-B和EOL-B為底物，酶用量10 FPIU/g，在pH值4.8、4 ℃、 150 r/min條件下反應3 h，Langmuir吸附等溫線及其參數如圖2和表2所示。

圖1 木質素添加量對纖維素酶解的影響Fig.1 Effects of adding isolated lignins on enzymatic hydrolysis of cellulose

圖2 不同木質素與纖維素酶蛋白的等溫吸附曲線Fig.2 Isothermal adsorption curves of different lignin and cellulase proteins

從圖2可以看出，MWL-B對纖維素酶等溫吸附曲線上的斜率大于EOL-B，意味著MWL-B與纖維素酶間的親和力大于EOL-B與纖維素酶間的親和力。MWL-B對纖維素酶最大吸附量為EOL-B的1.96倍，表明MWL-B上有更多的纖維素酶吸附位點。

表2 纖維素酶蛋白在不同底物上的Langmuir吸附等溫曲線參數Table 2 Langmuir adsorption isotherm parameters of cellulase proteins on different substrates

從表2可知，Langmuir常數K表示纖維素酶與底物之間的相對親和力，意味著在纖維素的酶水解過程中，不僅纖維素與纖維素酶之間有親和力，木質素與纖維素酶之間也有強的結合力，其中，MWL-B的纖維素酶親和力是EOL-B的1.17倍。因此，在酶水解過程中，木質素將會與纖維素競爭吸附纖維素酶。Langmuir方程中分配系數R用于估計纖維素酶與底物之間結合力的強弱。纖維素酶在Avicel、MWL-B和EOL-B上的R分別為0.47、 0.04和0.09，并且纖維素酶與MWL-B之間的分配系數是EOL-B的2.25倍。以上數據表明與MWL-B相比，EOL-B與纖維素酶之間具有較低的親和力和結合力，故對纖維素酶的最大吸附量也低于MWL-B。

因此，推測如下：相比MWL-B，在EOL-B上可能存在一些基團，能夠排斥、阻止纖維素酶的靠近，使纖維素底物周圍的酶蛋白濃度增加，進而促進了酶解效率，這與2.2節的分析結果相一致。

2.4紅外光譜分析

為了探討MWL-B和EOL-B的結構對酶水解和酶吸附的影響，分別對它們進行紅外光譜(FT-IR)分析，結果如圖3所示。從圖中b、c線可以看出，在1597、 1506和1427 cm-1處的吸收峰為木質素苯環骨架振動的特征吸收峰[17]，說明MWL-B和EOL-B具有木質素特有的苯環結構；1506 cm-1處的吸收峰為與苯環相連的C—H變形振動吸收峰。1330、 1270 cm-1處的吸收峰分別由紫丁香基和愈創木基的苯環伸縮振動引起。1165、 830 cm-1處的2個峰以及1162 cm-1處的肩峰[18]表明竹材木質素屬于典型的禾草類木質素(GSH型)，其大分子由對羥基苯丙烷、愈創木基丙烷和紫丁香基丙烷3種基本結構單元組成。以上結果表明：2個木質素模型物具有木質素的基本的苯基丙烷結構。

2.5核磁共振光譜分析

13C NMR是檢測木質素碳骨架結構的有效手段，可用來確定木質素的基本成分，如芳基醚鍵、縮合和非縮合的結構單元、甲氧基單元等信息，能提供木質素大分子的整體結構信息，MWL-B和EOL-B的13C NMR譜圖如圖4所示。

圖3 苦竹(a)、苦竹磨木木質素(b)和乙醇木質素(c)紅外吸收光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of bitter bamboo(a), MWL-B(b)and EOL-B(c)

圖4 苦竹磨木木質素(a)和乙醇木質素(b) 的13C NMR譜圖Fig.4 13C NMR spectra of MWL-B(a) and EOL-B(b)

從圖4可以看出，MWL-B(a)和EOL-B(b)的碳水化合物信號(δ90～102)強度很弱，說明這2種木質素中的糖含量較低，這與其化學成分分析中葡聚糖和木聚糖質量分數小于8 %是一致的，因此其作為模型物來分析木質素結構對纖維素酶水解和酶吸附的影響較為合理。木質素13C NMR的芳環區分為3個區域：δ140～160為氧化的芳基碳，δ123～140 為芳環碳碳鍵和δ103～123的芳環亞甲基碳[19-20]。與MWL-B相比較，EOL-B的氧化碳、芳環的碳碳鍵和芳環的亞甲基碳信號強度均降低，表明經乙醇預處理后，β-β、β-5鍵含量降低，即木質素中的β-β、β-5鍵發生了斷裂。EOL-B來源于乙醇預處理竹材后，溶解于乙醇中的木質素，從圖4還可以看出，在這一過程中，原本木質素在β碳上的烷醚鍵或芳醚鍵斷裂，并且斷裂后的小分子片段沒有繼續縮合，因此在EOL-B中凝縮單元少于MWL-B。研究已經表明木質素結構中凝縮單元含量高將增加木質素分子的疏水性能，終將增加木質素對纖維素酶蛋白疏水性氨基酸的吸附，導致酶水解效率降低[21]。

木質素各單元間的連接鍵的信號峰出現在δ50～90區域,β-O- 4′信號出現在δ72.3和δ60.2處，β-β位于δ71.9處，β-5在δ62.8處[19-20]。正如圖4所示，EOL-B在此區域的信號峰強度大于MWL-B，表明在乙醇預處理過程中，木質素的β-O- 4′斷裂，大分子碎片化，并且碎片化的小分子發生縮合反應的幾率較小。這與Hallac和Sannigrahi的研究結果一致[22-23]。β-O- 4′斷裂后，引入了大量的親水性基團羥基，這與EOL-B在FT-IR中3448 cm-1處的羥基的O—H振動吸收峰的強度大于MWL-B是一致的。此外，δ56.35處為甲氧基的信號峰，說明球磨過程中甲基芳醚鍵沒有斷裂。研究表明木質素分子與纖維素酶之間的疏水作用導致了它們之間的非特異吸附現象[24-25]。木質素分子上親水基團的增加，導致木質素分子親水性能增強，對纖維素酶產生排斥作用，從而使纖維素周圍纖維素酶的濃度增加，因此，EOL-B對纖維素酶的親和力和最大吸附量均小于MWL-B，加入EOL-B的纖維素的酶水解得率升高。

3 結 論

3.1從苦竹中提取乙醇木質素(EOL-B)和磨木木質素(MWL-B)，并以2種木質素為模型物添加到微晶纖維素中，研究木質素對纖維素酶解的影響。結果表明：當0.4 g微晶纖維素中加入40、80和160 mg EOL-B時，反應72 h葡萄糖得率逐漸升高，分別為56.06 %、 60.61 %和61.06 %；但葡萄糖得率隨MWL-B的添加量增大而降低，與對照葡萄糖得率51.34 %相比，加入8 g/L MWL-B的葡萄糖得率降低了10 %。

3.2與MWL-B相比較，EOL-B與纖維素酶之間具有較低的親和力和結合力，纖維素酶在MWL-B上的最大吸附量為EOL-B的1.96倍。

3.3MWL-B對纖維素酶的非生產性吸附降低了酶解得率；苦竹經乙醇預處理后，β碳上的芳醚鍵和烷醚鍵發生斷裂，引入了大量的親水性基團羥基，增加了木質素分子的親水性能，并在β碳上形成碳碳凝縮單元的機率較小，致使EOL-B分子對纖維素酶蛋白的吸附量減少，導致纖維素酶水解得率增加。

參考文獻:

[1]ZHANG K,PEI Z J,WANG D H.Organic solvent pretreatment of lignocellulosic biomass for biofuels and biochemicals: A review[J].Bioresource Technology,2016,199:21-33.

[2]蘇東海,孫君社.提高纖維素酶水解效率和降低水解成本[J].化學進展,2007,19(718):1147-1152.

[3]仉磊,李濤,王磊,等.糠醛渣的纖維素酶水解及其最優纖維素轉化條件[J].農業工程學報,2009,25(10):226-230.

[4]陳帥.酶水解對麥草纖維結構和性能及微纖絲初步制備的影響[D].西安：陜西科技大學碩士學位論文,2015.

[5]YAN Z P,LI J H,LI S Z,et al.Impact of lignin content on the sweet sorghum bagasse enzymatic hydrolysis[J].Energy Procedia,2014,61:1957-1960.

[6]LIU W,CHEN W,HOU Q X,et al.Surface lignin change pertaining to the integrated process of dilute acid pre-extraction and mechanical refining of poplar wood chips and its impact on enzymatic hydrolysis[J].Bioresource Technology,2016,228:125-132.

[7]LIN X L,QIU X Q,YUAN L,et al.Lignin-based polyoxyethylene ether enhanced enzymatic hydrolysis of lignocelluloses by dispersing cellulase aggregates[J].Bioresource Technology,2015,185:165-170.

[8]LI Y,QI B K,LUO J Q,et al.Effect of alkali lignins with different molecular weights from alkali pretreated rice straw hydrolyzate on enzymatic hydrolysis[J].Bioresource Technology,2016,200:272-278.

[9]LAI C H,TU M B,LI M,et al.Remarkable solvent and extractable lignin effects on enzymatic digestibility of organosolv pretreated hardwood[J].Bioresource Technology,2014,156(4):92-99.

[10]文甲龍.生物質木質素結構解析及其預處理解離機制研究[D].北京:北京林業大學博士學位論文,2014.

[11]史正軍.甜龍竹及巨龍竹半纖維素、木質素結構詮釋及相互間化學鍵合機制解析[D].北京:北京林業大學博士學位論文,2013.

[12]LI Y F,SUN Z P,GE X Y,et al.Effects of lignin and surfactant on adsorption and hydrolysis of cellulases on cellulose[J].Biotechnology for Biofuels,2016,9(1):1-9.

[13]BALLESTEROS I,OLIVAl J M,NEGRO M J,et al.Enzymic hydrolysis of steam exploded herbaceous agricultural waste(Brassicacarinata) at different particule sizes[J].Process Biochemistry,2002,38(2):187-192.

[14]CHEN M,ZHAO J,XIA L M.Enzymatic hydrolysis of maize straw polysaccharides for the production of reducing sugars[J].Carbohydrate Polymers,2008,71(3):411-415.

[15]SUN S L,HUANG Y,SUN R C,et al.The strong association of condensed phenolic moieties in isolated lignins with their inhibition of enzymatic hydrolysis[J].Green Chemistry,2016,18:4276-4286.

[16]ZHOU H F,LOU H M,YANG D J,et al.Lignosulfonate to enhance enzymatic saccharification of lignocelluloses: Role of molecular weight and substrate lignin[J].Industrial and Engineering Chemistry Research,2013,52(25):8464-8470.

[17]NONAKA H,KOBAYSASHI A,FUNAOK M.Behavior of lignin-binding cellulase in the presence of fresh cellulosic substrate[J].Bioresource Technololy,2013,135:53-57.

[18]GUO F F,SHI W J,SUN W L,et al.Differences in the adsorption of enzymes onto lignins from diverse types of lignocellulosic biomass and the underlying mechanism[J/OL].Biotechnology for Biofues,2014,7:38[2017-09-26].https://doi.org/10.1186/1754-6834-7-38.

[19]YANG H T,XIE Y M,ZHENG X,et al.Comparative study of lignin characteristics from wheat straw obtained by soda-AQ and kraft pretreatment and effect on the following enzymatic hydrolysis process[J].Bioresource Technology,2016,207:361-369.

[20]SUN S L,WEN J L,LI M F,et al.Revealing the structural inhomogeneity of lignins from sweet sorghum stem by successive alkali extractions[J].Journal of Aaricultural and Food Chemistry,2013,61(18):4226-4235.

[21]YU H,LI X,ZHANG W,et al.Hydrophilic pretreatment of furfural residues to improve enzymatic hydrolysis[J].Cellulose,2015,22(3):1675-1686.

[22]HALLAC B B,PU Y,RAGAUSKAS A J.Chemical transformations ofBuddlejadavidiilignin during ethanol organosolv pretreatment[J].Energy Fuel,2010,24(4):2723-2732.

[23]SANNIGRAHI P,RAGAUSKAS A,MILLER S.Lignin structural modifications resulting from ethanol organosolv treatment of Loblolly pine[J].Energy Fuel,2010,24(1):683-689.

[24]WANG W X,ZHU Y S,JING D,et al.Influence of lignin addition on the enzymatic digestibility of pretreated lignocellulosic biomasses[J].Bioresource Technology,2015,181:7-12.

[25]LI Y,SUN Z,GE X,et al.Effects of lignin and surfactant on adsorption and hydrolysis of cellulases on cellulose[J/OL].Biotechnology for Biofuels,2016,9(20)[2017-09-26].https://doi.org/10.1186/s13068-016-0434-0.