ApoC3基因高表達對小鼠急性胰腺炎嚴重程度的影響

姚瑤 林堃 莊璐 滿曉華 金晶 吳洪玉 龔燕芳 紀保安 黃浩杰 李兆申

近年來高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia,HTG)作為誘發急性胰腺炎(AP)的重要致病因素越來越受到重視。HTG型AP患者合并肝、腎、肺等其他重要臟器損傷的概率大大增加，可能導致重癥急性胰腺炎，預后較差，且復發率也更高[1-3]。載脂蛋白C(apolipoprotein C,ApoC)是血漿中一種水溶性低分子量蛋白質，在脂蛋白代謝過程中發揮重要作用，其中ApoC3含量最為豐富。ApoC3高表達可抑制血管內皮細胞表面的脂蛋白酯酶活性及肝臟對富含三酰甘油的脂蛋白殘體的攝取，導致HTG[4]。目前有研究[5]證明ApoC3轉基因小鼠的血漿三酰甘油水平明顯高于同齡野生型小鼠。本研究以ApoC3轉基因小鼠建立HTG模型，采用雨蛙素腹腔注射法誘發AP，探討ApoC3基因與血漿三酰甘油水平及AP之間的相互關系，為研究AP的發生機制提供方向。

材料與方法

一、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠由第二軍醫大學動物實驗中心提供，雄性ApoC3轉基因小鼠由北京大學心血管研究所提供。所有小鼠均為8～10周齡，體重約20 g，在12 h/12 h光照周期下飼養于第二軍醫大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，自由進食及飲水。血漿三酰甘油測定試劑盒購于北京中生北控生物科技公司。RNA Trizol提取液、Reverse Transcript試劑盒、SYBR?Green PCR試劑盒均購于TAKARA公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

二、動物分組及模型制備

12只C57BL/6J小鼠和12只ApoC3轉基因小鼠均隨機分為對照組及AP組，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素50 μg/kg體重10次、每次間隔1h的方法建立小鼠AP模型，以腹腔注射生理鹽水小鼠作為對照組。于第1次注射雨蛙素24 h后處死小鼠，取胰腺組織，置10%甲醛溶液固定。

三、血清三酰甘油及膽固醇水平測定

C57BL/6J和ApoC3轉基因對照組小鼠在處死前行眶靜脈取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心15 min，取血清，測定血清三酰甘油及膽固醇水平，按試劑盒說明書操作。

四、胰腺組織病理學檢查

取固定的胰腺組織行常規病理學檢查，根據高倍鏡下觀察到的胰腺組織水腫、出血、壞死、炎癥細胞浸潤等情況評估炎癥的嚴重程度[6]。

五、胰腺組織炎癥因子表達檢測

應用Trizol試劑提取胰腺組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄合成cNDA，再以cNDA為模板，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書進行定量PCR擴增。IL-1β上游引物為5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物為5′-CAGTTGTCTAATGGGAACGTCA-3′；IL-6上游引物為5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游引物為5′-ATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′；α-SMA上游引物為5′-ATGACCCAGATTATGTTTGAGACC-3′，下游引物為5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；TNF-α上游引物為5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物為5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；內參RPS6上游引物為5′-GATGATGTCCGCCAGTATGTT-3′，下游引物為5′-TTGTTCTTCTTAGTGCGTTGC-3′。每個組織樣本做2個復孔，通過LightCycler 480 system用最大二階導數法的高置信度算法獲得Ct值。以RPS6為對照，用相對定量分析法計算各炎癥因子mRNA的相對表達量。

六、統計學處理

結 果

一、小鼠血清三酰甘油和膽固醇含量

ApoC3轉基因小鼠的血清三酰甘油水平為(3.434±0.931)mmol/L，膽固醇含量為(2.553±0.178)mmol/L，明顯高于C57BL/6J小鼠的三酰甘油水平[(0.766±0.120)mmol/L]及膽固醇含量[(1.996±0.08)mmol/L]，差異均有統計學意義(t=2.245，P=0.03；t=2.494，P=0.026)。

二、小鼠胰腺組織病理學表現

肉眼見對照組的C57BL/6J小鼠和ApoC3轉基因小鼠胰腺均呈淡粉紅色，薄片狀，顏色均勻一致，光澤度好，無水腫及出血。AP組C57BL/6J小鼠胰腺呈淡粉紅色，輕度水腫，稍有出血，與周圍臟器部分粘連，AP組ApoC3轉基因小鼠胰腺顏色晦暗，水腫明顯，可見片狀出血，與胰腺周圍臟器有粘連。

光鏡下見AP組C57BL/6J小鼠胰腺輕度水腫，局灶性腺泡細胞壞死，小葉間隙增寬，小葉間及壞死灶內有炎細胞浸潤；AP組ApoC3轉基因小鼠胰腺明顯水腫，小葉間隙增寬、結構紊亂，腺泡細胞局限性或廣泛性壞死，小葉間及壞死灶內大量炎性細胞浸潤。對照組C57BL/6J和ApoC3轉基因小鼠胰腺形態學結構完好，未見明顯病理改變(圖1)。

圖1 各組小鼠胰腺組織的病理學改變(HE ×200)。1A：C57BL/6J小鼠對照組；1B：ApoC3轉基因小鼠對照組；1C：C57BL/6J小鼠AP組；1D：ApoC3轉基因小鼠AP組

三、小鼠胰腺組織炎癥因子mRNA的表達

AP組ApoC3轉基因小鼠胰腺組織IL-1β、IL-6、α-SMA mRNA表達量顯著高于C57BL/6J小鼠AP組(1.72±0.07比0.78±0.09、1.58±0.09比0.87±0.04、0.83±0.05比0.44±0.04)，差異有統計學意義(P值均<0.05)，而TNF-α mRNA表達量的差異無統計學意義(0.70±0.09比0.65±0.08，P>0.05)。對照組ApoC3轉基因小鼠與C57BL/6J小鼠IL-1β(0.80±0.10比0.65±0.09)、IL-6 (0.93±0.09比0.89±0.11)、TNF-α(0.76±0.09比0.69±0.10)、α-SMA(0.58±0.07比0.61±0.08)mRNA表達量差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

討 論

HTG主要由富含三酰甘油脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins, TRLs)的代謝障礙引起[7]。ApoC3抑制水解TRLs的三酰甘油的脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)活性引起血漿三酰甘油水平升高[8]。近年來有研究報道該基因的變異與動脈粥樣硬化、脂肪肝、糖尿病、腹主動脈瘤等HTG相關疾病的發生發展有著密切的關系[9-11]。臨床重癥急性胰腺炎患者通常有起病急、發病快、并發癥多、死亡率高的特點，據臨床統計有相當一部分患者合并HTG，但其具體發病機制尚未闡述清楚[12]。

本研究通過雨蛙素腹腔注射法構建ApoC3轉基因小鼠HTG型AP，結果顯示，與C57BL/6J小鼠相比，ApoC3轉基因小鼠的AP病理改變更加明顯，炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA表達水平均顯著升高，表明ApoC3轉基因小鼠在雨蛙素誘導后發生的AP更加嚴重。

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